不同成熟度诺丽果主要活性成分分析

徐 荣，许木果，姜士宽，杨 焱，付鎵榕，岩 利

（云南省热带作物科学研究所，云南景洪 666100）

诺丽（MorindacitrigoliaL.）为茜草科巴戟天属热带常绿多年生小乔木或阔叶灌木，多生长于赤道附近，以南太平洋各岛国为主［1-3］。近年来，我国海南、云南的热区陆续开展了诺丽引种栽培、良种选育等相关研究工作，独特的热带气候条件使得诺丽产业有望成为当地优势资源型新产业。诺丽果含有丰富的活性物质，如维生素、氨基酸、蛋白质、多糖、多酚类、蒽醌类、糖苷类和黄酮类化合物等［4］，其中又以多酚类、蒽醌类和黄酮类等化合物在诺丽果的生物活性方面起着关键作用，尤其是不同品种之间含量差异显著［5-6］。近年来，相关研究［7-10］对诺丽果的化学成分进行了分析测定，分离出大量的有效成分；对诺丽果及提取物的药用价值及保健功能也有很多研究，如抗氧化性、抑菌活性、降糖作用、增强免疫力、抗肿瘤、抗炎镇痛及心肌保护作用等［11-18］。综合以上研究结果，诺丽果实含有较丰富的功能性成分，具有较高的营养价值和保健功效，目前对诺丽的研究主要集中在不同品种间的含量差异及其药用机理、化学成分的分离鉴定上，对不同成熟度诺丽果中活性成分的含量差异及对比研究相关报道较少。

诺丽果是典型的呼吸跃变型果实，鲜果在采摘后不易保存，急需处理，且果实中种子含量多，气味不易被接受，难以鲜食。因此，深加工是发展诺丽特色优势农业产业的一个重要方向，而如何根据深加工的需要确定合理的采收时间，提高诺丽果实中有效成分的利用率及商品价值，需进行深入研究。为此，本试验对不同成熟度诺丽果中的8种主要活性成分进行测定和对比分析，以期为诺丽果的加工利用提供一定理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料与仪器

诺丽鲜果采摘于云南省热带作物科学研究所科研试验基地。11月初随机选择基地中长势基本一致的诺丽植株，取3种成熟度的鲜果，分别为青果（第一成熟度）、白果（第二成熟度）、熟果（第三成熟度），成熟度以果皮颜色、果肉色泽及果实软硬来区分。青果为青熟期果皮完好、呈青绿色硬果实，白果为白熟期果皮呈白色硬果实，熟果为完熟期果皮呈灰白色软果实。采收后的果实经清洗晾干，切片放置干燥箱中45℃烘干至恒重，粉碎后过100目筛，备用。

试剂：无水乙醇、苯酚、浓硫酸、硫酸亚铁、酒石酸钾钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、高氯酸、冰乙酸、氢氧化钠、浓盐酸、香草醛、氯仿等均为分析纯（购于国药集团化学试剂有限公司）；D101大孔吸附树脂（购于成都市科龙化工试剂厂）；1,8-二羟基蒽醌标准品（购于中国药品生物制品检定所）。

仪器：BGZ-240型电热鼓风干燥箱（上海博讯实业有限公司）；ME204E电子分析天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；LD5-2B低速离心机（北京雷勃尔离心机有限公司）；UV-1100紫外-可见分光光度计（上海美谱达有限公司）；HHS电热恒温水浴锅（上海博迅实业有限公司）；KQ-100DE数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；SHZ-D（Ⅲ）循环式真空泵（巩义市予华仪器有限责任公司）；Ultimate 3000高效液相色谱仪（美国塞默飞）。

1.2 方法

1.2.1 多糖含量测定

参照文献［19］的方法进行测定。称取诺丽果粉5.00 g于250 mL锥形瓶中，加入40 mL蒸馏水，搅拌溶解。沸水浴加热30 min，冷却后用蒸馏水定容至100 mL容量瓶中，准确移取5 mL样液于50 mL离心管中，加入20 mL无水乙醇，摇匀，4℃静置过夜，取出以4 000 r/min离心5 min，倾去上清液。沉淀加入10 mL无水乙醇再次离心，重复3次。沉淀加蒸馏水溶解定容至50 mL。取2 mL，加入6%苯酚溶液1 mL，再加入12 mL浓硫酸。摇匀后放入80℃水浴加热4 min，取出冷却至室温。于波长485 nm处测定吸光度。以葡萄糖使用量为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线，得到线性回归方程为y=0.348x-0.004（R2=0.9949），其中x为0.1 mg/mL葡萄糖溶液体积，y为吸光度值。

1.2.2 总酚含量测定

准确称取诺丽果粉6.000 g于250 mL三角锥瓶中，加入60 mL沸水浸提10 min，每隔3 min摇晃1次，减压过滤，用少量沸蒸馏水洗涤滤渣数次，待冷却后滤液定容至250 mL容量瓶中，摇匀，再准确吸取1mL置于25 mL比色管中，加入4 mL蒸馏水和5 mL酒石酸亚铁溶液，混匀，用磷酸缓冲液（pH7.5）定容至刻度。静置10～15 min，用10 mm的比色皿，在波长540 nm处，以试剂空白液为参照，测定吸光值。总酚的含量以干态质量分数表示，按下式计算：

式中：A为试样的吸光值；A0为空白液吸光值；L1为试液总量（mL）；L2为测定用液量（mL）；M为试样的质量（g）；m为试样干物质含量（%）；1.957是用10 mm比色杯，当吸光值等于0.50时，相当于每毫升样液中含多酚1.957 mg。

1.2.3 总黄酮含量测定

准确称取诺丽果粉2.000 g置于锥形瓶中，加入40 mL的70%乙醇，在超声温度60℃、超声频率100 W下提取30 min，过滤，滤渣再重复操作2次，合并滤液。取滤液3 mL于25 mL比色管中，加70%乙醇溶液至5 mL，之后加入1 mL 5%（w/v）NaNO2溶液，摇匀，放置6 min后再加1 mL 10%（w/v）Al（NO3）3溶液，摇匀，再放置6 min后加10 mL 1.0 mol/L NaOH溶液，最后加70%乙醇溶液至25 mL，摇匀，放置15 min，平行操作2次。在510 nm波长处测定吸光值。以芦丁质量浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线，得到线性回归方程为y=12.921x-0.0005（R2=0.9992），其中y为吸光度，x为芦丁质量浓度mg/mL。

1.2.4 皂苷含量测定

准确称取1.000 g诺丽果粉，置于100 mL三角瓶中，加入30 mL85%乙醇，在超声温度60℃、超声频率100 W下提取30 min，冷却，定容至50 mL，摇匀，放置。吸取上清液1 mL于60℃挥干后，以1 mL去离子水溶解残渣，进行柱层析。用10 mL注射器作层析管，内装3 cm预处理完成的D101大孔吸附树脂，用去离子水洗至无醇味，上加1 cm中性氧化铝。先用25 mL 70%乙醇溶液洗柱，弃去洗脱液，再用25 mL水洗柱，弃去洗脱液，加入1 mL诺丽样液，先用25 mL水洗柱，控制流速1.5～2 mL/min，弃去洗脱液，再用25 mL 70%乙醇洗脱，控制流速1.5～2 mL/min，收集洗脱液于蒸发皿中，置于60℃水浴挥干。在已挥干的蒸发皿中准确加入0.2 mL 5%香草醛-冰乙酸溶液和0.8 mL高氯酸，混匀后转入10 mL带塞比色管中，置60℃水浴上加热10 min，取出放置于流水中冷却后，准确加入冰乙酸5 mL，摇匀，放置20 min后，以1 cm比色皿于560 nm波长处测定吸光度值。以人参皂苷含量为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线，得到线性回归方程为y=3.308x-0.006（R2=0.9990），其中y为吸光度，x为人参皂苷含量μg/mL。

1.2.5 总蒽醌含量测定

准确称取诺丽果粉1.00 g，置于150 mL三角瓶中，准确加入2.5 mol/L硫酸溶液30.0 mL，在90℃水浴条件下回流水解2 h，放冷，过滤，酸液用氯仿萃取至无色。合并氯仿液，蒸干，残渣用甲醇溶解于10 mL容量瓶中并定容，再从容量瓶中准确移取样液1 mL用0.5%醋酸镁甲醇溶液定容于10 mL比色管中，以0.5%醋酸镁甲醇溶液为空白，于510 nm测定吸光度。以1,8-二羟基蒽醌浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线，得到线性回归方程为y=0.0412x+0.0052（R2=0.992），其中y为吸光度，x为蒽醌浓度μg/mL。

1.2.6 莨菪亭含量测定

准确称取诺丽果粉2.000 g，用60 mL甲醇于70℃回流提取1.5 h，合并提取液经减压至干后再用氯仿30 mL在超声温度60℃、超声频率100 W下提取2次，每次20 min，合并提取液经减压至干后用甲醇溶解至10 mL量瓶中，定容，经孔径为0.45μm的微孔滤膜过滤后备用。以莨菪亭浓度为横坐标x，峰面积为纵坐标y，绘制标准曲线，得到线性回归方程为y=87725x+23464（R2=0.995），其中y为吸光度，x为莨菪亭浓度mg/L。色谱条件：C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流动相为乙腈-1%冰醋酸水溶液（20∶80）；流速为1.00 mL/min；柱温为25℃；检测波长为341 nm；进样量：20μL。

1.2.7 桃叶珊瑚苷含量测定准确称取诺丽果粉1.000 g于150 mL具塞锥形瓶中，加入60%甲醇50 mL，常温下超声60 min，超声功率70 W，超声频率40 kHz，过滤，于50 mL容量瓶定容。取2mL于10 mL比色管定容，经孔径为0.45μm的微孔薄膜过滤器过滤，备用。以桃叶珊瑚苷浓度为横坐标x，峰面积为纵坐标y，绘制标准曲线，得到线性回归方程为y=1×107x+17805（R2=0.995），其中y为吸光度，x为桃叶珊瑚苷浓度mg/mL。色谱条件：C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流动相为乙腈-水（10∶90）；检测波长为203 nm；流速为1.0 mL/min；柱温为24℃；进样量：20μL。

1.2.8 蛋白质含量测定

参照国家标准方法（GB 5009.5-2010）中凯氏定氮法进行测定。

1.3 数据分析

试验数据用SPSS 20.0和Microsoft Excel 2016进行分析。

2 结果与分析

2.1 不同成熟度诺丽果中主要活性成分的测定结果

诺丽果主要活性成分的测定结果见表1和图1。由表1和图1可知，多糖、总酚、总黄酮、总皂苷、莨菪亭、桃叶珊瑚苷、蛋白质含量均是白果最高，而总蒽醌含量以青果最高。多糖、总黄酮、莨菪亭、桃叶珊瑚苷、蛋白质含量在青果中最低，总酚、总皂苷含量以熟果最低，总蒽醌含量以白果最低。各成分在不同成熟度诺丽果中含量差异较显著，其中总酚、总黄酮、总皂苷最低含量仅为最高含量的1/2左右，而莨菪亭、桃叶珊瑚苷最低含量不到最高含量的1/3，表明果实成熟度的选择可能会对后续加工所得产品的质量和有效性产生影响。

表1 诺丽果主要活性成分含量测定结果 g/kg

图1 不同成熟度诺丽果中活性成分含量

2.2 诺丽果成熟度与主要活性成分含量的相关性分析

相关性分析结果见表2，由表2可知，总黄酮和莨菪亭的含量与诺丽果实成熟度呈显著及以上正相关，与其他成分无显著相关性。进一步对诺丽果活性成分含量测定结果进行相关性分析发现，多糖与总黄酮、莨菪亭、桃叶珊瑚苷、蛋白质含量呈极显著正相关；总酚与总皂苷、蛋白质含量呈极显著正相关；总黄酮与莨菪亭、桃叶珊瑚苷、蛋白质呈极显著正相关；其他5种活性成分也有部分间存在显著及以上正相关。试验结果表明各活性成分之间具有一定的线性关系，不同活性成分间具有较强的相互影响及协同作用，可为诺丽果有效成分的提取利用提供一定的参考。

表2 诺丽果成熟度与主要活性成分的相关性分析

3 结论与讨论

诺丽虽在国内推广种植多年，但由于鲜果的气味和口感相对较差，目前仅属小众水果，在市场上还较少见，其果实绝大部分用来加工成果片、果粉、果汁和果酒等，经过加工后口感大幅提升的同时，还包含多种营养成分，兼具药用价值和保健功效，逐渐受到消费者的欢迎。通过本研究发现，不同成熟度诺丽果活性成分含量有较明显的差异，可将成熟度作为判定其是否适宜的采收和加工的一项关键指标。研究结果表明，诺丽果的总蒽醌含量为青果＞熟果＞白果，而其他成分含量均为白果的最高。相关研究表明，蒽醌类物质具有广泛的药用价值和生物活性，具有抑制或杀灭真菌，防治糖尿病及骨质疏松，抑制肿瘤细胞生长等作用［20］。因此，若需获取诺丽果中蒽醌类成分，宜选择青果时期的诺丽果进行后续加工；若需获取诺丽果中其他类型活性成分，选择白果进行后续加工较好。

通过测定结果发现，诺丽果蛋白质含量最高，测定结果范围为88.89～95.27 g/kg，这一结果接近于张伟敏等［21］的分析结果，而明显高于李晓花等［22］的测定值。多糖、总多酚、总黄酮作为广泛存在于诺丽果中的活性物质，其含量相对较高，对比相关文献［22-24］的提取测定结果，3种成熟度的果实多糖和总酚含量均高于文献提取测定值，总黄酮测定结果总体低于文献测定值。其他4种活性成分含量相对较低，相关研究报道较少，沈宋利等［25］对来自美国关岛的诺丽果粉中莨菪亭的测定值为2.08 mg/g，与本试验测定结果有明显差异；相关研究对诺丽果渣中总皂苷［23］和诺丽果浆中莨菪亭［26］成分进行测定，但由于属不同类型样本而无法对比。分析不同文献测定结果差异的原因，除受诺丽果成熟度影响外，可能还与诺丽的品种、种植区域及提取工艺等因素相关，今后还需对相关影响因子作进一步研究。