橡胶树炭疽病生防链霉菌DL5C发酵培养基筛选及发酵条件优化研究

李岚岚，施玉萍，刘一贤，戴利铭，蔡志英

（云南省热带作物科学研究所，云南景洪 666100）

炭疽病是橡胶树上的重要病害，在世界各植胶区均有发生，广泛分布于南美洲、非洲中部，亚洲南部和东南部等地。橡胶树炭疽病危害胶苗、幼树和开割胶树，侵染嫩叶、叶柄、嫩梢和果实等多个部位，引起嫩叶脱落、嫩梢回枯和果实腐烂等，严重时引起胶树重复落叶，导致开割时间推迟，该病在西双版纳地区胶苗苗圃中每年均有不同程度的发生［1］。

目前，橡胶树炭疽病的防治主要以化学药剂结合农业措施防治为主，农业防治措施难以大面积推广，且只能在短期内局部控制病情的蔓延；化学农药的不科学使用容易造成防效下降及抗药性等问题，也容易引起环境污染及农药残留等危害［1］。

已报道的防治炭疽病的生防菌种类较多，放线菌是目前次生代谢产物源抗生素的主要来源，其种类繁多、活性物质代谢功能各异。放线菌产生的抗生素被广泛应用于医学领域和农业领域［2-9］，在研发新型微生物农药领域具有极大的潜力。链霉菌是已知放线菌中最大的族群，四环素类、氨基糖甙类、头孢类、大环内脂类等多种类型的抗生素有70%～80%来源于链霉菌，其主要生物活性表现为抑菌活性［10］。

采用高效、环保、安全的综合防治措施是当今社会发展的需求，而放线菌在研发新型微生物农药领域具有极大的潜力，研究放线菌的最优生长培养基和最佳生长条件具有重要意义。本研究将对实验室筛选获得的强拮抗放线菌进行发酵培养基及发酵条件优化，以活菌数和抑菌率为指标筛选最优配比，为研制新型、环境友好型的生物杀菌剂提供前期基础。

1 材料和方法

1.1 供试菌株

土壤放线菌：链霉菌（DL5C），自景洪市打洛农场五分场橡胶园的土壤中分离得到，由所在实验室提供。

橡胶病原菌：炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides），从云南省热带作物科学研究所增殖苗圃的感病橡胶叶片上分离得到。

1.2 培养基

马铃薯琼脂培养基（PDA）［11］：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂15～20 g、水1 000 mL。

高氏1号培养基［11］：可溶性淀粉20 g、KNO31 g、K2HPO40.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、NaCl 0.5 g、FeSO4·7H2O 0.01 g、琼脂20 g，pH 7.5。

种子培养基：可溶性淀粉20 g、KNO31 g、K2HPO40.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、NaCl 0.5 g、FeSO4·7H2O 0.01 g，pH 7.5。

初始发酵培养基［11］：麦麸70%、稻壳5%、米糠10%、CaCO30.3%、料水比1∶0.8，pH 7.5。

2 方法

2.1 活化菌株及种子液制备

在高氏1号培养基上将保存在甘油管里的菌种进行活化。将活化后的菌种接种到150 mL种子培养基中，28℃、160 r/min振荡培育5 d。

2.2 碳源、氮源筛选

碳源筛选：在初始发酵培养基（CK）的基础上，分别添加10%的玉米粉、小米粉、蔗糖、麦芽糖、果糖和可溶性淀粉作为供试碳源进行试验，以初始发酵培养基为对照。每20 g干物质加入16 mL水拌匀装入500 mL三角瓶并编号，121℃，灭菌20 min，冷却后按20%的接种量接入种子液，置于恒温培养箱（温度32℃，湿度70%）中培养，每天振荡2次，培养7 d，取样测定活菌量及抑菌圈大小，选出最佳碳源［14-15］。

氮源筛选：在初始发酵培养基（CK）的基础上，固定碳源（最优碳源）10%，分别添加5%的酵母粉、硫酸铵、黄豆粉、花生粉饼、硝酸钾和蛋白胨作为供试氮源进行试验，以不添加氮源作为对照。其他发酵条件与碳源试验相同，培养7 d，取样测定活菌量及抑菌圈大小，选出最佳氮源［11-12］。

2.3 固体发酵培养基优化

确定最适的碳源和氮源后，运用L9（34）正交设计优化发酵培养基（表1）。以培养出的放线菌活菌量和培养物对病原菌的抑菌率为评价指标。

表1 L9（34）正交成份配比 %

2.4 固体发酵培养基发酵条件优化

2.4.1 种子液接种量确定

取培养5 d的种子液，分别以10%、15%、20%、25%、30%的接种量接到优化后的固体培养基上，培养7 d，测定固体发酵物中放线菌活菌量及抑菌圈大小。

2.4.2 料水比确定

分别以料水比0.8∶1、1∶1、1∶0.8配置固体培养基，以最佳接种量接入培养5 d的种子液，培养7 d，测定固体发酵物活菌量及抑菌圈大小。

2.4.3 起始p H确定

按最佳料水比，分别以起始pH 5.0、6.0、7.0、8.0、9.0配置固体培养基，以最佳接种量接入种子液，培养7 d，测定固体发酵物活菌量及抑菌圈大小。

2.4.4 发酵温度确定

将种子液以最佳接种量接入优化培养基中，分别以28、32、36、40℃培育，培养7 d，测定固体发酵物活菌量及抑菌圈大小。

2.4.5 发酵终点确定

将种子液以最佳接种量接入优化培养基中，最适温度下静置培养，从发酵第五天开始取样，每24 h取样1次，连续取样10 d，测定固体发酵物活菌量及抑菌圈大小，培养14 d后结束采样。

2.5 评价指标

2.5.1 放线菌量测定

平板菌落计数法：称取1 g发酵固体菌剂，加入9 mL无菌生理盐水充分摇匀，静置，取上清液做梯度稀释，取100μL稀释样液涂布到平板上，于32℃下培养5 d，测定固体发酵物活菌量。

2.5.2 抑菌率测定

称取1 g发酵固体菌剂，加入9 mL无菌生理盐水充分摇匀，静置，12 000 rpm，离心20 min后，取上清1 mL与约55℃的灭菌PDA混合均匀制成平板，接入直径为5 mm的炭疽菌饼，以不加发酵液的PDA平板为对照。5 d后测量菌落直径，计算抑菌率。

菌丝生长抑制率=（对照菌落生长直径-处理菌落生长直径）/（对照菌落生长直径-菌饼直径）×100%［13］。

3 结果与分析

3.1 碳源确定

如表2所示：玉米粉、小米粉、蔗糖、麦芽糖、果糖和可溶性淀粉等6种试剂为供试碳源时，以可溶性淀粉、小米粉、玉米为碳源，抑菌率不存在显著性差异，不同碳源对放线菌活菌数量和抑菌率存在一定影响。从活菌数量来看，小米粉和可溶性淀粉与其他处理之间存在显著差异；从抑菌率看，玉米、小米粉和可溶性淀粉与其他处理之间存在显著差异。活菌数量上来看，以玉米为碳源，菌量数与小米和可溶性淀粉存在差异，但是从抑菌率来看以玉米为碳源与小米粉和可溶性淀粉差异不显著。从节约成本的角度考虑，最终确定以玉米粉作为最佳碳源。

3.2 氮源确定

如表2所示：花生粉饼为氮源时，发酵物活菌量高于其他处理组，且存在显著差异；所有处理组的抑菌率都比较高，以花生粉饼作为氮源，抑菌率与黄豆粉和蛋白胨存在差异，但是从菌量数来看，以花生粉饼为氮源与其他处理差异极显著。并且考虑成本因素，花生粉饼的价格要低于黄豆粉和蛋白胨，所以最终确定以花生粉饼作为最佳氮源。

表2 不同碳源和氮源对放线菌的影响

3.3 放线菌菌株DL5C固体发酵培养基优化

运用L9（34）正交设计优化固体发酵培养基，结果如表3所示：不同因素的不同水平对放线菌的生长存在一定影响，正交试验中，因素A和因素D从菌落生长量来看是A1和D2为优势配比，从抑菌率来看是A2和D1为优势配比，但是由于实验室抑菌率的测定试验是在一个相对狭小的封闭空间内进行的，而实际运用中是在一个广阔开放的空间，所以我们在保证抑菌率的基础上选择产菌量较多的处理为培养基的最优配比，故以A1和D2为最优配比；因素B和因素C从菌落生长量和抑菌率来看都是B1和C2为最优配比；故最终确定发酵培养基的最优组合为A1B1C2D2组合（麦麸50%、玉米粉8%、花生粉饼5%、米糠10%、稻壳26.7%、CaCO30.3%)。

表3 培养基不同成分配比对放线菌的影响

3.4 最佳接种量测定

如表4所示：菌种接种量对放线菌的发酵培养影响较小，不同处理组之间活菌数和抑菌率均不存在显著性差异，不同接种量对放线菌的生长和抑菌率影响不大，从生长量和抑菌率看，所有处理组都较高，当接种量为20%时，发酵物活菌量和抑菌率均高于其他处理组，并且能够保证接入的菌种量能更均匀的分布在发酵培养基上，又不过于浪费。所以确定最佳接种量为20%。

表4 培养基不同接种量对放线菌的影响

3.5 最佳料水比测定

如表5所示：发酵培养基料水比对放线菌的发酵培养影响较小，不同处理组之间活菌数和抑菌率均不存在显著性差异，所以不同料水比对放线菌的生长和抑菌活性影响不大。由于实验室抑菌率的测定试验是在一个相对狭小的封闭空间内进行的，而实际运用中是在一个广阔开放的空间，所以我们在保证抑菌率的基础上选择产菌量较多的处理的料水比作为最佳发酵条件，所以确定最佳料水比为1∶1。

3.6 最适p H测定

如表5所示：不同pH对放线菌的生长和抑菌率有一定影响，从生长量来看，不同处理组之间差异极显著，处理1和处理2之间差异不显著，但是与其他处理之间差异极显著，产菌量显著高于其他处理；从抑菌率看，所有处理组的抑菌率都比较高，处理1和处理2之间差异不显著，与其他处理之间显著差异。当发酵培养基pH为5时，发酵物活菌量和抑菌率均高于其他处理组，所以确定最适pH为5。

表5 培养基不同料水比和ph对放线菌的影响

3.7 最适温度测定

如表6所示：不同发酵温度对放线菌的生长和抑菌率有一定影响，从生长量和抑菌率来看，不同处理组之间差异极显著，发酵温度为32℃时，发酵物活菌量和抑菌率均高于其他处理组，所以确定32℃为最适发酵温度。

3.8 发酵终点

如表6所示：不同发酵时间对放线菌的生长和抑菌率有一定影响，从生长量来看，不同处理组之间差异极显著，发酵10 d时，与其他处理之间存在极显著差异；从抑菌率来看，如表所示，发酵10 d和11 d时，与其他处理之间存在极显著差异，但是发酵10 d和发酵11 d，抑菌率上没有显著差异，从节省时间的角度看，以10 d为最适发酵时间。

表6 不同发酵温度和时间对放线菌的影响

4 结论与讨论

研究结果表明：链霉菌DLSC最优发酵培养基为麦麸50%、玉米粉8%、花生粉饼5%、米糠10%、稻壳26.7%、CaCO30.3%，最佳接种量20%；最佳发酵条件：最佳料水比1∶1，最适pH5，最适温度32℃，最佳发酵时间10 d，发酵活菌数达到2.20×1010CFU/g，抑菌率为92.22%。

研究发现：把发酵物浸泡在无菌水中，浸泡一段时间后取上清液过2μm微孔滤膜，用得到的液体进行指示菌抗性实验，发现滤去菌体的浸泡液对橡胶树炭疽病病原菌基本没有抑制作用，与张园园等人的研究结果不同，白刺链霉菌CT205固体发酵得到的无菌发酵产物对病原菌有抑制作用［11］。与实验室液体发酵得到的结果也不相同，液体发酵试验表明：液体发酵的无菌发酵液对橡胶树炭疽病病原菌有抑制作用。由此推测出现这种情况可能存在原因有：1）固体发酵和液体发酵DL5C产生的代谢产物不同，固体发酵产生的代谢产物对病原菌没有抑制作用；2）固体发酵和液体发酵产生代谢产物的水溶性不同，固体发酵产生的代谢产物可能不溶于水；3）固体发酵和液体发酵产生代谢产物的量不同，固体发酵产生的具有抑菌活性的物质的含量比较少，不足以对病原菌产生抑制作用。

本研究结果可为实验室后续的研究提供参考：1）以实验所得的发酵培养基为原料进行发酵培养，制成生物农药的粗成品，进行大田橡胶树炭疽病防治试验，评价该发酵产物是否有制成生物农药的价值；2）以实验所得的发酵培养基为研究对象，研究DL5C发酵培养后的储存稳定性和储存时间，为后续制作生物农药提供数据参考。