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超高效液相串联质谱法检测饲料中氯化胆碱含量

2022-04-28马爱平张忠一王爱卿刘嵩韩新安

北方牧业 2022年7期
关键词:氯化胆碱甲酸

马爱平,张忠一,★,王爱卿,刘嵩,韩新安

(1.沧州市农产品质量安全中心,河北 沧州 061000;2.河北省兽药饲料工作总站,河北 石家庄 050035)

氯化胆碱作为一种饲料添加剂, 对于动物来说,可预防动物肝脏、肾脏中的脂肪积累及其组织变性,可促进氨基酸的再组合,可以用来加快动物的生长过程, 确保动物的脂肪新陈代谢和神经功能正常,对于人类来说,可以提高氨基酸利用率,尤其是蛋氨酸在体内的利用率;帮助脂肪维持液态形式, 并防止不需要的胆固醇或脂肪积聚在动脉、 肝脏和膀胱中。 对于植物来说, 可以促进植物光合作用, 可用作饲料添加剂,对增加产量有明显的效果。 常用作甘薯生根剂和块根增大剂,比如用于玉米、马铃薯、萝卜、洋葱等增加产量,并广泛用于果树[1]。 目前常用的氯化胆碱测定方法有高氯酸非水滴定法、银量法、定氮法、四苯硼钠法、雷氏盐法[2,3,4,5]和离子色谱法[6]等。 前5 种方法均是采用化学法间接测定氯化胆碱, 方法选择性差, 干扰因素多; 检测饲料中氯化胆碱的国标方法有预混料中氯化胆碱的测定[6], 采用的仲裁方法为离子色谱检测法。

氯化胆碱化学式为C5H14ClNO,为白色的结晶粉末,极易吸湿。 熔点305℃,易溶于水和醇类,在碱性溶液中不稳定,在甲酸水溶液中会解离为C5H14NO+离子和Cl-离子,如图1 所示:

图1 氯化胆碱分子结构

本试验根据氯化胆碱的性质, 对前处理步骤和仪器方法进行创新。 采取水溶液提取,C18色谱柱分离,达到快速准确,高效低耗的试验目的,可以作为有效的检测手段。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

仪器:Waters UPLC Xevo TQ 超高效液相串联质谱仪(美国沃特世公司)、色谱柱:BEH C18(50 毫米×内径2.1,粒径1.7 微米)、北京永光明DZKW-D-2 电热恒温水浴锅、 德国IKA KS501振荡混匀器、100 毫升容量瓶, 梅特勒-托利多TLE204 天平(万分之一)、粉碎机。

试剂:乙腈(色谱纯)、甲酸铵(色谱纯)、水(应符合GB/T 6682 一级水指标)。

标准品:氯化胆碱(农业农村部环境质量测试中心, 含量≥95%), 称取氯化胆碱标准品0.1005g,置于100 毫升容量瓶中,用水溶解稀释至刻度,摇匀,浓度为1 毫克/毫升。

1.2 样品处理

饲料样品用粉碎机粉碎, 通过0.42 毫米孔筛。 称取1 克样品(精确到0.0001 克),置于100毫升容量瓶中,加入约60 毫升水,在70℃的水浴锅中加热20 分钟, 转至振荡器立即振荡10分钟,冷却至室温,用水定容至容量瓶刻度线,摇匀后过滤, 用初始流动相逐级稀释至适当浓度,过0.22 微米水系滤膜,上机测定。

1.3 液相条件

柱温:40℃,进样室温度:20℃,流速0.3 毫升/分钟,进样量1 微升,流动相A:乙腈;流动相B:2 毫摩尔/升甲酸铵水溶液。液相梯度设置见表1。

表1 液相梯度设置表

1.4 质谱条件

电离模式:ESI+;扫描方式:MRM;离子源温度150℃,脱溶剂温度450℃,毛细管电压0.5 千伏,锥孔电压30 伏,碰撞能量15 电子伏特,碰撞气为氩气,流速50 升/小时,脱溶剂气为氮气,流速900 升/小时。

1.5 结果计算

上机测定后,根据外标峰面积法定量。

氯化胆碱含量计算公式:

式中:

X——试样中氯化胆碱的含量, 单位为毫克/千克

C——上机溶液的浓度,单位为纳克/毫升

V——定容试样总体积,单位为毫升

n——过滤后溶液的稀释倍数

m——称量试样的总质量,单位为克

2 结果与分析

2.1 质谱条件的优化

根据氯化胆碱的性质, 质谱采用正离子监测模式,选取C5H14NO+为母离子,分别对毛细管电压、锥孔电压、碰撞能量和离子对等质谱参数进行了优化,在子离子扫描状态下,选取碰撞后响应最高的子离子为定量子离子, 次高的离子为定性子离子。 确定母离子104.1,定量子离子60.1,定性子离子45.0。

2.2 色谱条件的优化

色谱条件的优化主要考虑以下几个方面。

一是选择最常用的C18 反相色谱柱, 虽然其对极性较强的化合物保留时间较短, 但是经过试验发现,其能够满足实验要求,且能够缩短液相方法的时间。

二是流动相的选择,考察以下几个方面。

考察了水相中是否加入甲酸铵的区别。 上机溶液为1 纳克/毫升时, 若水相中未加入甲酸铵,104.1>45.0 离子对峰型较差, 所以选择水相中加入甲酸铵,浓度为2 毫摩尔/升。

考察了水中是否加入1‰甲酸的区别。一般高效液相色谱串联质谱检测时会在水相中加入甲酸,利于维持样品在流动相中的电离状态,可以改善峰形。 但经过实际对比实验,水相中不加甲酸氯化胆碱信噪比明显升高。 因此采用了水相中不加甲酸的方法。

考察了甲醇-水、 乙腈-水两种常见流动相体系对目标化合物的影响。 在甲醇体系中初始有机相比例分别在2%、10%、20%、30%、40%的情况进行了对比实验。 发现随着有机相比例的升高,氯化胆碱响应值逐渐增高,信噪比未有明显改善(见表2)。

表2 甲醇-水体系中不同比例有机相对氯化胆碱检测的影响

在乙腈体系流动相中,发现相比甲醇体系,乙腈体系中氯化胆碱峰高也随着有机相比例的提高而增高,信噪比明显改善(见表3)。

表3 乙腈-水体系中不同比例有机相对氯化胆碱检测的影响

综合考虑,决定选择乙腈体系,出峰时的有机相比例选择40%(见图2)。

图2 乙腈体系有机相比例为40%时离子色谱图(1ng/毫升)

2.3 前处理条件的优化

氯化胆碱易溶于水,熔点305℃,遇热不易分解。 因此前处理时直接用水提取,使用水浴加热提高溶解度,震荡促进氯化胆碱溶解,饲料中杂质较多,使用定容后过滤的方法净化,过滤时注意防止沉淀堵塞滤纸,必要时可更换新的滤纸过滤。

2.4 线性范围和定量限

配制2、5、10、20、50 纳克/毫升浓度基质标准溶液,经上机测定,保留时间为0.43 分钟、 标准曲线线性方程为y=856.956x+62.9086、相关系数r 为0.999739、 定量限为0.0001毫克/千克。 线性范围能够满足检测要求, 定量限远低于国家标准方法定量限。

2.5 加标回收率和精密度

分别选取肉仔鸡前期配合饲料、仔猪浓缩饲料、南美白对虾配合饲料三种饲料进行检测, 所得数值为样品含量; 在样品中添加前述浓度为1 毫克/毫升的氯化胆碱标准溶液0.5 毫升, 按照前处理步骤检测,所得数值为样品添加含量。 重复平行测定6 次得出相对标准偏差和平均回收率,从表4 可以看出,试验重复性和回收率均取得较好效果。

表4 加标回收率和RSD%

3 结论

实验建立了利用高效液相色谱-串联质谱法测定饲料中氯化胆碱的检测方法,该方法通过比较不同流动相对检测结果的影响, 优化质谱参数, 可以快速简便地测定配合饲料和浓缩饲料中氯化胆碱的含量,定量准确,回收率满足分析要求。 本方法具有重复实验数据稳定、线性关系良好、定量限远低于国家标准的优点,适合于配合饲料和浓缩饲料的快速检测, 也为饲料添加剂氯化胆碱检测提供了新方法。

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