猪场口蹄疫O 型病毒抗体检测与分析

谷冉坤，张秀卫，贾亚淼，甄江

（1.赵县动物疫病预防控制中心，河北 赵县 051530； 2.石家庄市农业综合行政执法支队，河北 石家庄 050000）

我国将口蹄疫病列入一类动物疫病首位，对所有养殖场实行强制免疫口蹄疫疫苗的政策，要求免疫群体免疫密度常年保持90%以上，免疫抗体合格率常年保持在80%以上。 为切实了解猪场口蹄疫抗体水平，科学评价口蹄疫疫苗免疫效果，我疫控中心在3 个猪场采集血清，用猪口蹄疫O 型病毒VPI 结构蛋白抗体酶联免疫吸附试验的方法检测口蹄疫O 型病毒VPI 结构蛋白抗体，对免疫结果进行评价，为今后我县猪口蹄疫的防治研究提供技术支持。

1 材料和方法

1.1 试验猪场

随机选择3 个猪场做实验， 分别用A、B、C场表示，3 个猪场均为自繁自养， 全进全出的饲养方式。 A 场存栏800 头、B 场存栏1500 头，C场存栏1200 头。

1.2 疫苗接种情况

3 个猪场使用的疫苗均为申联生物 （上海）股份有限公司生产的猪口蹄疫O 型合成肽疫苗（多肽2600+2700+2800）， 一瓶50 毫升， 批号20210104，按照疫苗说明书要求，三个猪场兽医均在2021 年4 月份对猪场40 日龄以上的健康猪肌肉注射1 毫升该疫苗，间隔1 个月后再次注射1 毫升，病猪、瘦弱、怀孕后期及断奶前的仔猪没有接种，接种后猪只未出现过敏反应。

1.3 检测方法

用猪口蹄疫O 型病毒VPI 结构蛋白抗体酶联免疫吸附试验的方法检测口蹄疫O 型病毒抗体，检测试剂盒为郑州中道生物技术有限公司生产，检测时间为2021 年10 月份。

2 样品前处理

随机采集3 个猪场免疫猪的全血， 采集A场血样30 份，B 场30 份、C 场30 份，共90 份血样，用高速离心机分离出血清，血清清亮无溶血，对血清样品进行编号，A 场样品编号1-30 号，B场样品编号31-60 号，C 场样品编号61-90 号。

3 实验仪器设备及试剂

3.1 仪器设备：100 毫升量筒、500 毫升烧杯，离心管架、电热恒温培养箱、微型振荡器、酶标分析仪、洗板机、1.5 毫升离心管、纯化水、0.5～10 微升、10～100 微升和100～1000 微升单道移液器、30～300 微升的多道移液器、不同型号的吸头、玻璃棒、移液槽等。

3.2 实验试剂为郑州中道生物技术有限公司生产的猪口蹄疫O 型病毒VPI 结构蛋白抗体酶联免疫吸附试验诊断试剂盒，批号：20210701，用于检测猪血清中的口蹄疫O 型病毒VPI 结构蛋白抗体，适用于评估猪口蹄疫合成肽疫苗免疫状况，2℃～8℃保存。

3.3 试剂盒组成

3.3.1 抗原包被反应板96T×2 包

3.3.2 阴性对照血清1.5 毫升×1 瓶

3.3.3 阳性对照血清1.5 毫升×1 瓶

3.3.4 样品稀释液50 毫升×1 瓶

3.3.5 酶标记结合物21 毫升×1 瓶

3.3.6 显色剂A 11 毫升×1 瓶

3.3.7 显色剂B 11 毫升×1 瓶

3.3.8 终止液11 毫升×1 瓶

3.3.9 浓缩洗涤液（20×）50 毫升×1 瓶

3.3.10 说明书1 份

3.3.11 自封袋2 个

3.3.12 封板膜6 张

3.3.13 96T 稀释板2 个

4 检验原理

微孔板上包被的人工合成的猪口蹄疫O 型病毒VPI 结构蛋白多肽， 可与待测样品中的特异性抗体（抗-FMDV-VPI）反应，形成抗原-抗体复合物被吸附到固相上， 再加入酶标记的抗猪IgG，则形成“固相猪口蹄疫O 型病毒VPI 结构蛋白抗原-猪口蹄疫O 型病毒VPI 抗体-抗猪抗体-HRP”免疫复合物，洗涤后，如待测样品中含有猪口蹄疫O 型病毒VPI 结构蛋白抗体， 加入显色剂即显色，为阳性，反之为阴性。

5 检验方法

5.1 实验前准备： 提前2 小时从冰箱取出所用试剂恢复至室温，放置1 小时以上，使用前充分摇匀，实验完毕后放回2℃～8℃保存。

5.2 配洗涤液：将浓缩洗涤液（20×）用纯化水进行20 倍稀释，用量筒准确量取10 毫升浓缩洗液加入到盛有190 毫升纯化水的烧杯中，用玻璃棒轻轻搅拌均匀后备用。

5.3 编号：在包被板上设阴性对照2 孔，阳性对照2 孔，其余为待检样品孔。

5.4 待检样品预稀释：按照编号在稀释板的各待检样品孔中将待检样品进行1∶32 稀释，取5微升待检血清样品加入到155 微升样品稀释液中，稀释每个样品时必须使用不同的吸头。 阴性对照和阳性对照不进行预稀释。

5.5 加样和温育： 取出抗原包被反应板，分别从稀释板上取稀释后的待检血清100 微升，阴性对照孔加入阴性对照血清100 微升，阳性对照孔加入阳性对照血清100 微升。 贴上封板膜，放37℃恒温箱中温育30 分钟。

5.6 洗板机洗板： 按洗板机操作说明洗板5次。

5.7 加酶标结合物: 在抗原包被反应板各孔中加入酶标结合物100 微升。 贴上封板膜，放37℃恒温箱中温育30 分钟。

5.8 洗板机洗板： 按洗板机操作说明洗板5次。

5.9 加显色剂：每孔加入显色剂A 50 微升，全部加完后再在每孔加入显色剂B 50 微升，混匀。 放37℃恒温箱中显色10 分钟。

5.10 终止：显色完毕后立即于每孔加50 微升终止液，混匀。

5.11 测定： 用酶标仪在450 纳米波长处测定吸光值。

6 结果判定标准

6.1 试验成立条件： 阴性对照平均OD 值应≤0.2，每个阳性对照孔OD 值应≥0.5，否则试验无效。

6.2 试剂盒临界值（Cut Off 值）= 0.23×阳性对照孔平均OD 值，若阳性对照孔平均OD 值≤2.0， 则按实际值计算， 若阳性对照孔平均OD值＞2.0，则按2.0 计算。

6.3 若待检样品孔OD 值＜Cut Off 值， 判为阴性， 即为抗口蹄疫病毒VPI 结构蛋白抗体阴性。若待检样品孔OD 值≥Cut Off 值，判为阳性，即为抗口蹄疫病毒VPI 结构蛋白抗体阳性。

7 检测结果与分析

90 份样品均按上诉步骤进行检测， 阴性对照平均OD 值为0.182＜0.2，2 个阳性对照孔OD值分别为0.689、0.692,均＞0.5，此次试验成立。根据检测结果判定标准， 分析待检样品孔OD 值，判断得出以下结果：

检测结果显示：3 个猪场的血清样品口蹄疫0 型病毒VPI 结构蛋白抗体合格率分别86.66%、93.33%、83.33%， 均超过了国家规定的抗体合格率在80%以上的标准，免疫效果很好。

样品口蹄疫O 型病毒VPI 结构蛋白抗体结果汇总表

8 结论

8.1 通过检测3 个猪场的口蹄疫O 型病毒VPI 结构蛋白抗体， 个体抗体合格率都比较高，均超过了国家规定的大于80%的标准， 群体免疫合格率100%，整体免疫效果很好。 免疫1 次，间隔1 个月再免疫1 次猪口蹄疫O 型合成肽疫苗，猪机体即可产生较高的抗体水平，抗体持续时间达到6 个月以上，说明猪免疫接种口蹄疫合成肽疫苗是预防猪口蹄疫发生的最有效手段。

8.2 今后继续贯彻落实国家强制免疫口蹄疫疫苗的政策， 做到所有养殖场免疫全覆盖，免疫密度达到100%。养殖场必须建立健全防疫制度， 重视生物安全管理，加强消毒灭源，规范引种，坚持自繁自养、全进全出的饲养模式，采取综合防控措施，控制口蹄疫的发生。动物疫病预防控制机构要加大对口蹄疫抗体检测力度，增加抽样检测点，及时汇总、分析动物疫情和监测流调信息，定期组织专家开展分析研判和风险预警，监测发现口蹄疫强制免疫抗体合格率不达标、免疫失败的群体，按照有关免疫规定督促养殖场户及时补免，为县域口蹄疫防控决策提供技术支持。