基于指纹图谱结合化学模式识别法评价不同浸渍时间炎痛止塌渍液的质量*

李莹莹，杨春静，雷敬卫，贾豪，张维方，龚海燕，纪亮

1.河南中医药大学，河南 郑州 450046； 2.河南省中药质量控制与评价工程技术研究中心，河南 郑州 450046； 3.河南中医药大学第三附属医院，河南 郑州 450000

膝关节骨性关节炎(knee osteoarthritis，KOA)是临床常见的慢性退行性骨关节疾病，多发于中老年人群[1-2]。中医认为该病属“骨痹”范畴，《素问·痹论》云：“风寒湿三气杂至，合而为痹”，即风寒湿入侵膝关节，导致气血不通，经络痹阻，久之引发疼痛、关节僵硬、肿胀积液[3]，临床治疗常以活血化瘀、通络止痛为主[4-6]。中药塌渍疗法最早见于《五十二病方》，通过中药煎汤外敷治疗疾病。《黄帝内经》有云“其有邪者，渍形以为汗”，元代《外科精义》载“溻渍法，疮疡在四肢者，溻渍之。疏导腠理，通调血脉，使无凝滞也”。传统中药塌渍方法是用6～8层纱布浸透药液做为药垫直接湿敷于患处结合特定电磁波治疗器照射患处的一种外治法[7-8]。中药外用塌渍液有其独特优势，临床研究表明，采用中药塌渍液治疗老年KOA的总有效率显著高于对照组[9]；实验研究表明，活血痛痹汤塌渍液可通过下调下游基因MMP3、MMP13、BMP2等的表达治疗兔KOA[10]。目前，中药塌渍液治疗KOA已广泛用于临床。炎痛止(yantongzhi，YTZ)塌渍液是河南中医药大学第三附属医院自拟处方，由红花、川芎、三七、血竭、透骨草、伸筋草、杜仲、制乳香、制没药、蜈蚣、狗脊、地龙、冰片、自然铜14味药物组成，用于住院期KOA患者的治疗。处方采用冷浸法，将上述中药材混匀，置容器内辅以70%乙醇密闭，浸渍15～30 d 滤过，塌渍患处[11]。

中医药现代化趋势要求确定中医药自我主体的前提下，以科学技术为依托，吸收利用现代科学技术成果，建立严谨的方法学体系，形成科学模式，从而建立中医药学自身标准系统[12-13]。高效液相色谱(high performance liquid chromatography，HPLC)是一种综合的、可量化的分析评价方法[14]，化学计量学方法可对大量数据进行模式识别并分析量化[15]，两者相结合是目前相对完整评价药材质量整体性的方法，也是现代科学技术手段同传统中医疗法相结合的有效研究方法。目前，有学者利用高效液相联用质谱技术建立三七药酒、冯了性风湿跌打药酒的指纹图谱[16-17]。现今对于塌渍液成分研究较少，临床应用中对其具体浸渍时间仅有经验值，而不同浸渍时间下塌渍液内在成分是否一致，何为发挥药效的主要成分仍不清楚。基于此，本研究采集YTZ不同浸渍时间塌渍液的HPLC指纹图谱，结合模式识别方法(相似度评价、灰色关联度分析、主成分分析、正交偏最小二乘法判别分析)对其进行评价，旨在探讨YTZ浸渍过程中的动态信息及不同浸渍时间的整体化学组分差异，为研究YTZ塌渍液物质基础及浸渍平衡点提供科学依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器Waters e2695型高效液相色谱仪(美国Waters公司)；101-3AB型电热鼓风干燥箱、DZKW-4型电子恒温水浴锅、FW-100型高速多功能粉碎机(北京中兴伟业仪器有限公司)；HQ-700DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；四号药典筛(浙江上虞市五四仪器筛具厂)；BSA224S-CW型万分之一天平、CPA225D型十万分之一电子天平(赛多利斯科学仪器北京有限公司)。

1.2 材料羟基红花黄色素A对照品(纯度≥98.11%)、川芎嗪对照品(纯度≥99.95%)、人参皂苷Rg1对照品(纯度≥99.44%)(成都曼斯特生物科技有限公司，批号：MUST-20080111、MUST-19051403、MUST-19022811)；血竭素高氯酸盐对照品(纯度≥98%，上海源叶生物科技有限公司，批号：Y17M97H56341)；甲醇(色谱纯，美国Tedia公司，批号：MS1922-801)。本实验所用饮片由河南中医药大学第三附属医院中药房提供，经河南中医药大学陈随清教授鉴定均为正品。

2 方法与结果

2.1 YTZ塌渍液HPLC指纹图谱

2.1.1 对照品溶液的制备精密称取适量羟基红花黄色素A、川芎嗪、人参皂苷Rg1及血竭素高氯酸盐对照品至5 mL容量瓶中，加入甲醇定容至5 mL，即得混合对照品溶液。

2.1.2 样品制备根据处方称取红花、川芎、三七、血竭、透骨草、伸筋草、杜仲、制乳香、制没药、蜈蚣、狗脊、地龙、木瓜、冰片和自然铜粗粉各三份，分别置于广口瓶中，编号为1、2、3。加入处方药材8倍量的70%乙醇，取浸渍1～50天的塌渍液。将三个瓶子中1～50 d塌渍液样品编号为1-1、1-2…1-50，2-1、2-2…2-50，3-1、3-2…3-50。

2.1.3 供试品溶液制备取25 mL样品溶液，并补足广口瓶内减失体积，过滤后精密吸取20 mL续滤液置65 ℃水浴得恒重浸膏，30%甲醇溶解，转移至 5 mL 容量瓶中，加入30%甲醇定容至5 mL，过 0.45 μm 微孔滤膜即得。

2.1.4 色谱条件Venusil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5.0 μm)；流动相：甲醇(A)-水(B)；梯度洗脱(0～15 min，5%～10%A；15～20 min，10%～16%A；20～40 min，16%～31.5%A；40～50 min，31.5%～32%A；50～60 min，32%～34%A；60～75 min，34%～37%A；75～90 min，37%～41%A；90～100 min，42%A；100～110 min，42%～44%A；110～120 min，44%～48%A；120～130 min，48%～51%A；130～135 min，51%～52%A；135～145 min，52%～100%A；145～150 min，100%A)；流速 1 mL·min-1；柱温25 ℃；进样量20 μL；检测波长203 nm。

2.1.5 方法学考察精密度试验：精密量取1-40塌渍液样品1份，按2.1.3项下方法制备供试品溶液，按照2.1.4项下色谱条件连续进样6次，以川芎嗪为参照峰，计算得到各共有峰的相对保留时间相对标准偏差(relative standard deviation，RSD)值为0.00%～0.79%，相对峰面积RSD值为0.00%～1.87%，表明仪器精密度良好。

重复性试验：精密量取1-40塌渍液样品6份，按2.1.3项下方法平行制备供试品溶液6份，按照2.1.4项下色谱条件进样，以川芎嗪为参照峰，计算得到各共有峰的相对保留时间RSD值为0.00%～1.31%，相对峰面积RSD为0.00%～2.90%，表明实验重复性良好。

稳定性试验：精密量取1-40塌渍液样品1份，按2.1.3项下方法制备供试品溶液，分别在0 h、3 h、6 h、9 h、12 h、24 h按2.1.4项下的色谱条件进样，以川芎嗪为参照峰，计算得到各共有峰的相对保留时间RSD值为0.00%～0.85%，相对峰面积RSD为0.00%～1.93%，表明供试品溶液稳定性良好。

2.1.6 YTZ塌渍液指纹图谱的建立及相似度评价取YTZ供试品溶液，按照2.1.4项下色谱条件进样，采集HPLC指纹图谱。应用中药色谱指纹图谱评价软件(2004A)对YTZ塌渍液供试品溶液的HPLC指纹图谱进行分析，采用中位数法将3份第 1～50天塌渍液的HPLC指纹图谱生成HPLC叠加图谱S1～S50。将S1～S50图谱导入相似度评价软件，设定时间窗宽度为0.3，采用中位数法，经全谱峰匹配后生成对照图谱，对照图谱相似度结果为0.428～0.747。该相似度结果低，可能是由于不同浸渍时间的YTZ塌渍液差异较大。以相似度结果为筛选条件，对S1～S50的指纹图谱进行筛选，经筛选后S1～S50图谱分为两组，S1～S26相似度为0.922～0.991，S27～S50相似度为0.944～0.994。两组样品均标定11个共有峰，其中峰1为羟基红花黄色素A，峰4为川芎嗪，峰10为人参皂苷Rg1，峰11为血竭素高氯酸盐，且川芎嗪(峰4)的重复性和分离度都较好。见图1。

图1 不同浸渍时间YTZ塌渍液叠加指纹图谱及对照图谱

2.2 灰色关联度分析

2.2.1 原始数据的规格化处理基于50份HPLC指纹图谱中的11个共有峰面积，建立不同时间YTZ质量灰色模式识别数据集，由于其量纲不统一，对原始数据进行规格化处理，采用均值化处理，使规格化后的数据具有可比性。设有a个样品，每个样本有b项评价指标，组成评价单元序列{Xtk}(t= 1，2，3…a；k= 1，2，3…b；本实验中 a=50，b=11)，按公式1对不同时间YTZ指纹图谱数据进行规格化处理。式中，Ytk为规格化处理后的数据，Xtk为原始数据，Xk为a个样品第k个指标的均值。

2.2.2 参考序列的选择采用灰色关联度为综合评价指标时需要确定参考序列，即需要选出最优参考序列和最差参考序列，最优参考序列{YLk} (k= 1，2，3…b)，是a个样品中各项对应指标的最大值，最差参考序列{Ysk} (k= 1，2，3…b)，为a个样品中各项对应指标的最小值。

2.2.3 关联度计算关联度是指对于两个数据列间的因素，随时间或不同对象而变化的关联性大小的量度。不同数据组间相对关联度大、分布范围密集表明分布质量更优。

根据公式依次计算出不同浸渍时间样品的相对关联度，并按照ri大小排序。由灰色关联度分析计算结果，根据50 d样品的11个共有峰峰面积数据的分析，浸渍1～26 d及27～50 d的相对关联度范围分别是0.278 3～0.502 2和0.468 2～0.659 4，表明浸渍27 d后塌渍液的质量明显优于浸渍前 26 d 的塌渍液质量。见表1。

表1 不同浸渍时间YTZ塌渍液的相对关联度

2.3 聚类分析以不同浸渍时间YTZ塌渍液的11个共有峰峰面积为原始数据，采用SPSS 19.0软件对数据进行系统聚类分析，采用Ward法，以平方Euclidean距离为分类依据，当平方Euclidean距离为5时，塌渍液样品被分为4类，浸渍6～26 d、1～5 d、42～50 d、27～41 d分别聚为一类，表明浸渍时间对YTZ塌渍液内在质量存在影响；当平方Euclidean距离为14时，塌渍液样品被分为3类，1～26 d、42～50 d、27～41 d分别聚为一类，表明浸渍42～50 d，27～41 d塌渍液与浸渍前26 d存在一定差异；当平方Euclidean距离为20时，塌渍液样品聚为两大类，1～26 d、27～50 d聚为两类，表明两个样品组之间存在明显差异。见图2。

图2 YTZ不同浸渍时间塌渍液聚类分析树状图

2.4 主成分分析以不同浸渍时间YTZ塌渍液11个共有峰峰面积为变量，采用SPSS 19.0软件对数据进行降维因子分析，抽样适合性检验(kaiser-meyer-olkin，KMO)统计量为0.805>0.7，巴特利球体(bartlett)检验统计量为0.000，表明各因子间关联性好，适合主成分分析。以特征值>1为标准，提取出2个主成分，二者的方差贡献率分别为52.394%和17.182%，累计方差贡献率为69.576%>60%，表明该分析能比较全面地表征其化学成分特征。根据方差贡献率，计算不同浸渍时间塌渍液的综合得分。见表2、表3。

表2 主成分分析方差贡献率

表3 不同浸渍时间YTZ塌渍液的综合得分

2.5 正交偏最小二乘法判别分析(orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA)以不同浸渍时间YTZ塌渍液11个共有峰峰面积为变量，运用SIMCA-P 14.1软件，采用有监督模式的OPLS-DA对样品进行分析发现，不同浸渍时间样品可明显区分开，与聚类分析和主成分分析结果基本一致，表明不同浸渍时间样品内部化学特征信息存在明显差异。对变量重要性投影值(variable importance in the project，VIP)参数进行分析，筛选出对样品分类贡献较大的成分。VIP<1时，表明该变量对模型贡献度较低；VIP>1表示该变量对整体模型的贡献度高于平均水平，其中VIP>1的峰为峰1(羟基红花黄色素A)、峰11(血竭素高氯酸盐)、峰4(川芎嗪)、峰10(人参皂苷Rg1)，提示这4种成分在区分不同浸渍时间的YTZ塌渍液中起到重要作用，是产生差异的主要标志性成分。见图3、图4。

图3 OPLS-DA散点得分图

图4 VIP得分图

3 讨论

前期实验发现在不同体积分数的甲醇、乙醇作为复溶溶剂，不同流动相(甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.05%磷酸水)，不同柱温(25 ℃、30 ℃、35 ℃)，不同波长(203 nm、210 nm、230 nm、280 nm、310 nm)，不同体积流速(0.8 mL·min-1、1 mL·min-1)，不同进样量(10 μL、20 μL) 条件下检测时，以甲醇-水为流动相，在柱温25 ℃、波长203 nm、流速1 mL·min-1、进样量20 μL条件下检测出现的色谱峰分离度好，基线平稳，响应值较好。

中药塌渍液质量与其内在化学成分种类及含量相关。本研究所建立的HPLC指纹图谱可反映其中多数具有紫外吸收的化学成分信息，对不同浸渍时间YTZ塌渍液指纹图谱分析时发现，浸渍1～26 d，27～50 d YTZ指纹图谱相似度均大于0.9，表明浸渍1～26 d时塌渍液成分差异不大，且浸渍 27～50 d YTZ塌渍液成分差异不大，而浸渍1～50 d的YTZ塌渍液的相似度在0.428～0.747间，表明 1～50 d YTZ塌渍液成分差异较大。以11个共有峰的峰面积为指标，进行灰色关联度分析、主成分分析发现浸渍27～50 d的塌渍液质量优于1～26 d的塌渍液质量。聚类分析中1～26 d与27～50 d的YTZ塌渍液可明显聚为两大类。利用有监督下的 OPLS-DA分析筛选出区分不同浸渍时间YTZ塌渍液的主要标志性成分分别为羟基红花黄色素A、血竭素高氯酸盐、川芎嗪、人参皂苷Rg1。羟基红花黄色素A(hydroxysafflor yellow A，HSYA)归属于红花，是红花活血化瘀的主要物质基础。文献报道HSYA可通过促进核仁素表达，调节血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor A，VEGFA)水平，进而促进血管新生[18-19]；血竭素高氯酸盐归属于血竭，有活血、止血、镇痛抗炎的作用[20]；川芎嗪归属于川芎，是川芎的特征性生物碱[21]，可上调 5-羟色胺受体达到镇痛作用，还可抑制二磷酸腺苷(adenosine diphosphate，ADP)诱导的凝血作用，可能是川芎活血行气及镇痛的基础物质[22-23]；人参皂苷Rg1归属于三七，是三七活血止血双向作用的代表成分[24]，可抑制凝血酶诱导的血小板黏附和聚集[25]。本研究的指纹图谱中所指认的四种成分可分别代表YTZ处方中红花、血竭、川芎、三七的主要药效成分，并在文献中已证实其有活血化瘀、镇痛消炎之效，结合模式识别分析可尝试将这4种成分作为评价YTZ塌渍液质量优劣的重要指标。

中药塌渍又称为中药蒸煮疗法、药透疗法等，是中医外治法中的一种，塌渍液湿敷达到消炎、镇痛、止痒和抑制渗出等作用。塌渍液临床疗效确切，而在推广使用过程中却缺乏标准规范，如浸渍时间不定、物质基础不明确等问题。本研究初步建立了YTZ塌渍液不同浸渍时间的HPLC指纹图谱，可将其用于塌渍液浸渍过程的质量分析，而在研究过程中确定的4种差异性成分在YTZ塌渍液中如何发挥其活血化瘀、镇痛消炎的药效作用，有待进一步研究。