“冰片-郁金”药对挥发油成分治疗心绞痛作用机制的网络药理学研究

★ 王朝平 罗晶,2,3 曹美芳 殷宁 杨明,2,3 雷志强（.江西中医药大学药学院 南昌 33000；2.现代中药制剂教育部重点实验室 南昌 33000；3.创新药物与高效节能降耗制药设备国家重点实验室 南昌 33000；.江西中医药大学临床医学院 南昌 33000）

心绞痛是冠状动脉供血不足，心肌急剧的暂时缺血与缺氧所引起的以发作性胸痛或胸部不适为主要表现的临床综合征。中医称心绞痛为胸痹或真心痛，其认为心绞痛是由于正气亏虚，痰浊、瘀血等因素引起的一种疾病，因此，活血化瘀、通脉止痛类的中药可治疗该疾病。郁金与冰片具有活血化瘀，行气止痛等功效，二药合用，一开窍，一行气，一醒神，一化瘀，郁金助冰片开窍醒神，冰片助郁金行气化瘀。现代研究表明，“冰片-郁金”药对挥发油可治疗痹症，痰饮，且具有来源广，成本低，产量高，易吸收等多种优点，已经成为近年来的研究热点。

现基于网络药理学，从多成分-多靶点-多途径分析“冰片-郁金”药对挥发油成分治疗胸痹的作用机制，为心绞痛的治疗及临床研究提供科学依据。

1 数据收集

1.1 疾病靶点的收集

通 过DisGeNET［1］和Drugbank［2］数 据 库 以“Angina”为检索词获取与心绞痛相关靶点共401 个。

1.2 中药挥发油成分测定及收集

1.2.1 GC-MS 测定郁金和冰片挥发油成分采用气相色谱质谱联用技术（GC-MS）测定郁金与冰片挥发油成分。取郁金挥发油100 μL，用无水乙醚定容至10 mL，取冰片100 mg 用无水乙醇定容至10 mL，过滤，待测。

冰片挥发油GC-MS 条件：气相色谱柱为Agilent HP-5MS（30 m×250 μm×0.25 μm），初始温度为40 ℃（保留3 min）后运行至70 ℃，以10 ℃/min升温至300 ℃，保留5 min，平衡时间0.3 min，最高温度320 ℃；汽化室温度250 ℃；，载气为高纯He（99.999%），样品体积1 μL，柱前压7.069 9 psi，分流流量14 mL/min，分流比10∶1。质谱离子源为EI，四极杆温度150 ℃；EMV 模式增益因子1.00；EMV电压为1 000 V；质量扫描范围50～650 amu。

郁金挥发油GC-MS 条件：气相色谱柱为Agilent DB-624（30 m×320 μm×1.8 μm），初始温度为40 ℃（保留2 min）后运行至70 ℃，以10 ℃/min 升温至220 ℃,再以20 ℃/min 升温至300 ℃，保留5 min，平衡时间0.3 min，最高温度320 ℃；汽化室温度250 ℃；载气为高纯He（99.999%），样品体积1 μL，柱前压5.282 9 psi，分流流量44 mL/min，分流比40∶1。质谱离子源为EI，离子源温度230 ℃；四极杆温度150 ℃；EMV 模式增益因子1.00；EMV 电压为2 447 V；质量扫描范围50～650 amu。

1.2.2 收集挥发油成分根据相对含量最终筛选出“郁金-冰片”药对挥发油成分22 个（两味药有2 个挥发油成分重复）。见表1。郁金中相对含量＞1%的挥发油成分10 个，冰片中相对含量＞2%的挥发油成分14 个。郁金和冰片挥发油成分离子流色谱，见图1-2。

图1 郁金挥发油成分离子流色谱图

图2 冰片挥发油成分离子流色谱图

1.3 中药靶点的收集

通过PubMed［3］数据库查询得到挥发油成分的smiles 编码，利用该编码在Swiss Target Prediction［4］数据库中获取郁金与冰片挥发油成分相关靶点，最终筛选出“郁金-冰片”药对挥发油成分靶点共532 个。

2 数据分析

2.1 “郁金-冰片”药对挥发油成分与心绞痛共有靶点的获取

使用Image GP 平台将上述筛选出来的药对挥发油成分靶点与心绞痛的靶点进行匹配并映射出韦恩图。见图3。共有靶点18 个，其中郁金挥发油成分与心绞痛特有靶点2 个，冰片挥发油成分与心绞痛特有靶点4 个，两者挥发油成分与心绞痛复合靶点12 个。表明“郁金-冰片”药对挥发油成分在治疗心绞痛时既可以独立发挥作用，又相互协调、相须相使，同时以12 个复合靶点作为关键靶点。见表2。

表1 “郁金-冰片”有效挥发油活性成分

图3 “郁金-冰片”挥发油成分靶点与心绞痛靶点的匹配

表2 挥发油成分关键靶点

2.2 挥发油成分关键靶点的相互作用网络分析

将12 个关键靶点导入String 数据库得到关键靶点基因的蛋白质相互作用网络关系，并用Cytoscape 绘制蛋白质相互作用关系网络图。见图4。图中共有10 个节点，12 条边。图中颜色表示Degree 值，橙色Degree 值为3，蓝色Degree 值为2。其中Degree 值为3 的靶点基因是CYP1A2、CHRM2、CHRM1、UGT2B7，表明这4 个靶点基因在关系网络中具有重要地位，可作为研究“郁金-冰片”药对挥发油成分治疗心绞痛的重要靶点基因。

图4 挥发油成分关键靶点相互作用网络图

2.3 关键靶点基因的生物学功能及通路分析

运用Rstudio 软件对12 个关键靶点进行GO 生物学功能和KEGG 通路富集分析。GO 分析结果根据P 值筛选出前20 个功能。见图5。主要涉及G蛋白偶联受体信号通路类，信号传导类，对铵离子反应类，对乙酰胆碱反应类等生物功能，其中腺苷酸环化酶调节G 蛋白偶联受体信号通路，G 蛋白偶联受体信号通路与环核苷酸第二信使偶联两条生物功能分别有6 个靶点与之对应，推测其具有重要作用。表明“郁金-冰片”挥发油成分在治疗心绞痛时可以通过调控多种生物学功能而发挥作用的。

图5 “郁金-冰片”靶点GO分析结果

KEGG 富集分析结果根据P值共筛选出10 条途径。见图6。主要是神经活性配体-受体相互作用，胆碱能突触，药物代谢-细胞色素P450，钙离子通道，调节肌动蛋白细胞骨架等，其中神经活性配体-受体相互作用对应6 个靶点，胆碱能突触以及调节肌动蛋白细胞骨架有5 个靶点与之对应，推测这3 条通路具有主导作用。结果表明“郁金-冰片”挥发油成分靶点可以不同的通路途径，相互协调，共同达到治疗心绞痛的目的。

图6 “郁金-冰片”靶点重要通路

2.4 中药-挥发油成分-靶点-通路关系网络图的构建

利用Cytoscape 软件构建中药-挥发油成分-靶点-通路关系网络。见图7。图中共有46 个节点，157 条边。颜色表示Degree 值，颜色由深到浅，Degree 值依次减小。根据Degree 大于4 筛选出13个挥发油成分分别是右旋樟脑、吉马烯D、桉油醇、莪术烯、δ-榄香烯、α-蒎烯等，推测其为其发挥主要作用的挥发油成分；Degree 大于8 的靶点有8 个分别是UGT2B7、CHRM2、CYP2C19、TERT、CYP1A2、CHRM3、CHRM1、CHRM4，说明其为挥发油成分主要靶点；重要通路是神经活性配体-受体相互作用、钙信号通路等。该分析表明上述挥发油成分、靶点及通路在治疗心绞痛的整个过程中都发挥着主导作用，可作为治疗疾病以及药物开发的重点研究对象。

图7 中药-挥发油成分-靶点-通路关系网络图

3 讨论

“郁金-冰片”药对为临床常用经典药对，治疗神昏谵语，冠心病，心绞痛，癫痫等疾病。《温病条辨》曰：“此芳香化秽浊而利诸窍，咸寒保肾水而安心体，苦寒通火腑而泻心用之方也。郁金草之香，梅片木之香，雄黄石之香，麝香乃精血之香，合四香以为用，使闭固之邪热温毒深在厥阴之分者，一起从内透出，而邪秽自消，神明可复也。”虽然“郁金-冰片”药对对心绞痛等疾病有很好疗效，但其作用机制尚不明确。

本研究中，12 个挥发油成分关键靶点的相互作用网络关系图表明，CYP1A2、CHRM2、CHRM1、UGT2B7 在关键靶点中具有重要地位，且这4 个靶点在图7 中对应的Degree 值都大于8，推测其在治疗心绞痛的整个过程中发挥主导作用。CHRM1、CHRM2 属于较大的G 蛋白偶联受体家族，毒蕈碱乙酰胆碱受体介导各种细胞反应，包括腺苷酸环化酶的抑制，磷酸肌醇的分解和通过G 蛋白的作用调节钾通道；它们主要在副交感神经系统中表达，发挥抑制和兴奋作用。研究表明心肌和神经肌肉都需要有相对恒定的钾离子浓度来维持正常的应激性。血清钾过高时，对心肌有抑制作用，可使心跳在舒张期停止，血清钾过低能使心肌兴奋，可使心跳在收缩期停止［5-6］；同时M2 受体的活化促进磷脂酶C 活性，导致肌醇三磷酸（IP3）的释放，然后这会触发Ca2+释放到胞质溶胶中。当Ca2+浓度过高时会引起冠状动脉痉挛，心肌收缩，血压升高，心脏负荷加重等一系列症状［7-8］。其中CYP1A2 和UGT2B7 靶点在治疗心血管方面的作用机制尚不明确，还需进一步深入研究。

对19 个关键靶点的GO 分析显示，关键靶点涉及的主要生物功能是腺苷酸环化酶调节G 蛋白偶联受体信号通路，G 蛋白偶联受体信号通路与环核苷酸第二信使偶联等；此外“郁金-冰片”挥发油成分关键靶点富集的主要通路是神经活性配体-受体相互作用，钙信号通路，胆碱能突触等［9-11］。以上表明“郁金-冰片”挥发油成分靶点可以通过不同的生物学功能及代谢通路，共同参与治疗心绞痛。

在中药-挥发油成分-靶点-通路关系网络的构建中，根据Degree 值筛选出的13 个主要挥发油成分在GC-MS 测定结果中含量能达5%以上的有7 个，分别是右旋樟脑、莪术烯、α-蒎烯、（4R，8S）-7-亚异丙基-4a-甲基-1-亚甲基 - 十氢 - 萘、右旋龙脑 、［（1S，4S）-1,7,7-三甲基-2-双环庚基］乙酸酯、D-柠檬烯。其中右旋樟脑、莪术烯、α-蒎烯可与5 个及以上靶点相关联，推测其对于心绞痛的治疗起主要作用。研究表明炎症因子与心血管疾病有关，并且在心血管功能异常患者中炎症因子明显高于正常人［12］，而樟脑、α-蒎烯等挥发油成分有助于降低炎症因子水平预防炎症反应性物质引起的损伤［13-14］。网络图中某些非关键挥发油成分也具有重要作用，如桉油醇对钙激活钾通道有抑制作用［15］，也具有降低炎症因子水平的能力［16］，在治疗心血管疾病方面具有双重机制。β-榄香烯对氧化损伤的血管内皮细胞有保护作用，能够抑制平滑肌细胞的增殖和迁移，可以减轻实验性再狭窄动物模型的内膜增生程度，降低再狭窄率，因此β-榄香烯是一种很有价值的抗血管再狭窄药物［17］。结果表明“郁金-冰片”挥发油在治疗心绞痛过程中多成分协同充分发挥作用，为治疗心绞痛的药物研发提供新方向。其中部分成分如莪术烯、右旋龙脑、［（1S，4S）-1,7,7-三甲基-2-双环庚基］乙酸酯、D-柠檬烯等挥发油成分在治疗心绞痛方面还未有报道。

综上所述，运用网络药理学对“郁金-冰片”药对挥发油作用机制进行研究，初步阐明该药对的主要挥发油成分，作用靶点及靶点生物学功能和相关通路，在研究治疗心绞痛方面具有重要意义。可结合临床及相关实验深入研究其作用机制，进一步完善和丰富中药挥发油成分治疗心绞痛的研究。