香附四物汤全方与组方药材挥发油经皮外用“药辅合一”作用研究

姚俊宏,任略,2,董洁,2,顾薇,2,陆姗姗,陈军,2

(1.南京中医药大学江苏省中医外用药开发与应用工程研究中心,江苏 南京 210023;2.南京中医药大学药学院,江苏 南京 210023)

经皮给药是中药除口服以外最常用的给药途径之一,但由于皮肤角质层屏障的存在,大部分活性成分很难透皮吸收,从而严重限制了其药效的发挥。应用透皮促渗剂(Penetration enhancer, PE)是改善药物透皮吸收最常用的有效策略[1],而中药挥发油是一大类性质优良的PE,具有较高的促渗效果[2]和较低的皮肤刺激性[3]。与化学PE不同的是,挥发油PE中的成分多为小分子脂溶性成分,其透皮吸收能直接产生药理活性[4-5],即具有“药辅合一”的作用特点。

香附四物汤是中医治疗痛经的经典方,出自《不知医必要》[6],全方由当归、川芎、白芍、熟地黄、木香、香附及延胡索7味药材组成,其中当归、川芎、木香、香附4味药材富含挥发油[7],且均有作为PE使用的报道[8-10],与痛经治疗作用密切相关[11-12]。前期研究已将香附四物汤开发为经皮外用贴剂,具有给药方便、药效延长的优点[13]。中药通常复方配伍应用,目前已有中药药对挥发油作为PE研究的报道[14],但研究全方挥发油作为PE应用时的“药辅合一”作用尚处于空白。本文提取香附四物汤全方挥发油,并与组方药材挥发油进行体外促渗效果、皮肤细胞毒性和对离体子宫收缩抑制作用的比较,为合理选择挥发油PE应用于香附四物汤经皮外用制剂提供科学依据。

1 材料

1.1 仪器

PTHW型调温电热套(南通市通州申通电热器厂);TGL-16B型高速离心机(上海安亭科学仪器厂);7890A-5975C型气相色谱质谱联用仪(美国Agilent公司);NIST11质谱数据库(美国国家标准技术研究所);TK-12D型透皮扩散试验仪(上海锴铠科技贸易有限公司);Millicell ERS-2细胞膜电阻仪(美国Millpore公司);CO2培养箱(德国Memmert公司);SW-CJ-IF型超净工作台(苏净安泰公司);XD-202型倒置显微镜(江南永新公司);Chromate 4300型酶标仪(美国Awareness公司);MPA2000多导生理仪(北京吉安得尔科技有限公司)。

1.2 试药

当归、川芎、白芍、熟地黄、木香、香附、延胡索药材饮片均购于苏州天灵中药饮片有限公司,由南京中医药大学药学院刘圣金副教授鉴定符合2020年版《中国药典》一部要求。氮酮(国药集团化学试剂有限公司，批号：20150104);缩宫素注射液(四川金科药业有限责任公司,批号：20180601);苯甲酸雌二醇注射液(四川金科药业有限责任公司,批号：20180101),盐酸维拉帕米(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批号：20181102)，其余试剂均为分析纯。

1.3 细胞与动物

人永生化表皮角质形成细胞(HaCaT细胞),购于江苏凯基生物股份有限公司,以DMEM培养基(含10%胎牛血清及100 U·mL-1青霉素-链霉素溶液),37 ℃培养于5%CO2细胞培养箱中。

雌性SD大鼠,体质量180～220 g,SPF级,购于南京青龙山动物繁殖场,许可证号:SCXK(苏)2019-0001。实验过程中对动物的处理遵守科技部颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》的规定,通过南京中医药大学动物伦理委员会批准(批准号：201911A028)。

2 方法

2.1 中药挥发油的制备

所有挥发油均通过水蒸气蒸馏法提取。按质量比当归∶川芎∶白芍∶熟地黄∶木香∶香附∶延胡索(6∶3∶3∶8∶2∶3∶3)全方配伍(处方来源于《不知医必要》[6]),提取香附四物汤全方挥发油。另称取各含挥发油组方药材(当归、川芎、木香、香附),粉碎后,加6倍量水浸泡一定时间,连接挥发油提取器和冷凝管,自冷凝管上端加纯水至溢出挥发油提取器支口,加热保持微沸状态,提取至挥发油的量不再增加,停止加热。放冷至室温,加入适量无水硫酸钠脱水,于4 ℃避光密封保存。

2.2 GC-MS成分分析

2.2.1 供试品制备 精密称定挥发油0.10 g于10 mL量瓶中,乙酸乙酯定容,12 000 r·min-1离心10 min,取上清液进行GC-MS成分分析。

2.2.2 GC-MS分析条件 HP-5MS色谱柱(5%苯甲基聚硅氧烷石英毛细管柱,30 m×0.25 mm,0.25 μm);载气为氦气,流速1 mL·min-1;离子源为EI源,电离能量70 eV,离子源温度230 ℃;进样口温度250 ℃,进样体积1 μL,采取分流进样方式进行分析。具体检测条件参见表1。

表1 不同挥发油GC-MS分析的条件参数

2.3 皮肤电阻法评价挥发油促渗效果

皮肤屏障功能的强弱可以通过皮肤电阻值进行评价,电阻值减小表明皮肤屏障功能下降[15]。将大鼠皮肤自然解冻,固定于Transwell的24孔小室上,角质层向上,向接收室内加入0.65 mL的PBS,皮肤上层加入0.2 mL含3%挥发油的溶液(溶剂为70%异丙醇-PBS),空白对照组加入等体积的溶剂,以化学PE氮酮为阳性对照。将24孔小室置于37 ℃恒温水浴中,插入细胞电阻仪电极,平衡数秒后读取电阻值,即为初始电阻R0,并于给药后的1、2、3、4、5、10、15、20、30、40、50、60 min时读取电阻值,即为Rt,以R0/Rt对时间t作图,并对曲线中直线部分进行线性回归,所得直线斜率K即为衡量不同挥发油的透皮促渗能力的参数,按公式计算促渗倍数ER=K挥发油/K空白对照。

2.4 挥发油皮肤细胞毒性评价

取对数生长期的HaCaT细胞,以0.25%胰蛋白酶溶液消化后,以含10%胎牛血清的DMEM稀释,每孔7 000个接种于96孔细胞培养板上,置于培养箱培养12 h,弃去培养基,每孔加100 μL不同浓度的挥发油溶液,溶剂为含1%DMSO的DMEM培养基,设5个复孔,以空白溶剂组为对照孔,以不含细胞的培养基作为调零孔,以化学PE氮酮为对照。继续培养24 h,弃去给药液,每孔加入0.83 mg·mL-1的MTT溶液120 μL,培养4 h,弃去MTT溶液,加入150 μL DMSO,摇床振荡10 min,用酶标仪于570 nm处测定吸光度值。存活率(%)=(A挥发油-A调零孔)/(A空白对照-A调零孔)×100%。挥发油对细胞的毒性以半数抑制率(IC50)作为评价指标,IC50采用GraphPad Prism 8计算。

2.5 离体子宫收缩模型评价挥发油生物效应

雌性SD大鼠,实验前3 d,每天皮下注射苯甲酸雌二醇,剂量为10 mg·kg-1·d-1,第4天动物安乐死后摘取子宫,小心去除子宫上黏附的血管及肌肉。将子宫取出后立即放入预冷的Lock's液中清洗后,将子宫连接于张力换能器上,加入预热37 ℃的Lock's液,通入含5%CO2的氧气。调节子宫负荷质量,待子宫收缩幅度恢复节律后,开始记录收缩曲线,加入缩宫素(0.01 U·mL-1)诱导子宫异常收缩,记录一段收缩曲线后,加入相应组别的挥发油,挥发油终浓度为0.02 μg·mL-1,以空白溶剂为阴性对照,Ca2+通道阻滞剂维拉帕米作为阳性对照。按抑制率=(给药前参数—给药后参数)/给药前参数×100%,计算给药后子宫平滑肌收缩幅度、收缩频率及肌张力的变化。

3 结果

3.1 挥发油GC-MS成分分析

5种挥发油GC-MS成分对比如表2所示,提取的香附四物汤全方挥发油中主要成分为藁本内酯,占总成分的43.54%,来自处方中川芎与当归,川芎油和当归油中含有藁本内酯分别为38.69%和80.28%。全方挥发油的化学成分不仅仅等同于各组方挥发油组成的简单叠加,与组方药材挥发油相比,全方挥发油共产生了16种新成分,与川芎油的共有成分最多,共10种成分。

表2 香附四物汤全方挥发油及与各组方药材挥发油成分比较

3.2 皮肤电阻法评价不同挥发油的促渗效果

不同挥发油处理离体皮肤后,电阻随时间变化见图1,相比空白对照组,5种挥发油对离体大鼠皮肤的电阻值均有影响,电阻值随挥发油作用时间的延长呈现逐步降低的趋势,表明挥发油干扰了皮肤的屏障作用。挥发油对离体大鼠皮肤电阻的影响依次为:木香油>香附油>全方挥发油>川芎油>氮酮>当归油。对结果进行t检验,如表3所示,全方挥发油及4种组方挥发油均具有显著的透皮促渗效果(P<0.05,P<0.01),全方挥发油、香附油和木香油的促渗效果显著强于化学PE氮酮(P<0.05,P<0.01),其中全方挥发油的促渗作用较强，是化学PE氮酮的2.5倍。

图1 挥发油处理后大鼠离体皮肤电阻比值-时间曲线Fig. 1 Electrical resistance ratio-time curve of isolated skin

表3 挥发油处理后大鼠离体皮肤电阻变化率结果Table 3 Electrical resistance change rates of isolated skin treated with EOs

3.3 皮肤细胞毒性研究结果

以IC50值评价不同挥发油对人角质形成细胞的毒性作用,结果如表4所示,香附四物汤全方挥发油与4种组方药材挥发油的细胞毒性均显著低于化学PE氮酮(P<0.05,P<0.001),中药挥发油对皮肤细胞刺激性较低,其中对皮肤细胞毒性作用表现为当归油≈川芎油<全方挥发油<香附油<木香油。

表4 挥发油作用于HaCaT细胞的IC50值Table 4 IC50 of HaCaT treated with

3.4 离体子宫收缩实验结果

提取的5种挥发油对大鼠离体子宫平滑肌收缩幅度、收缩频率及肌张力的影响如图2所示,与空白对照组相比,除川芎油外其余4种挥发油均显著抑制了平滑肌收缩频率和幅度(P<0.05,P<0.01，P<0.001),其中对平滑肌收缩幅度抑制作用全方挥发油>当归油>维拉帕米>木香油>香附油>川芎油,对平滑肌收缩频率的抑制率全方挥发油>香附油>木香油≈维拉帕米>当归油>川芎油。此外,除川芎油和香附油,其余3种挥发油均显著降低子宫平滑肌肌张力(P<0.05,P<0.01,P<0.001),全方挥发油与阳性药效果相当,抑制率分别为66.98%和67.00%,其次为木香油53.64%,当归油作用略弱,抑制率为44.33%。

综合分析离体子宫收缩实验的3个评价指标表明:在同等剂量下,香附四物汤组方提取的挥发油抑制子宫收缩的生物效应明显强于各组方药材挥发油。

注:与空白对照组比较,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。图2 挥发油对大鼠离体子宫平滑肌收缩幅度、收缩频率及肌张力的作用Fig. 2 The activities on contraction amplitude, contraction frequency, and muscle tension of rat uterine smooth muscle of EOs

4 讨论

挥发油作为中药的组成部分,品种总数达300余种,是中药药理活性的重要物质基础,其中有34种中药挥发油作为PE应用[16],与化学PE相比具有“药辅合一”的作用优势。前期研究表明21种辛味中药挥发油中有11种挥发油PE促渗效果优于经典化学PE氮酮[2],本文提取了香附四物汤全方挥发油和已有促渗研究报道的木香油、香附油、当归油和川芎油,通过皮肤电阻法,发现除当归油外的4种挥发油促渗效果均优于氮酮;5种中药挥发油的皮肤细胞毒性均显著低于氮酮(P<0.05)。其中全方挥发油促渗作用仅次于木香油和香附油,但是皮肤细胞毒性低于木香油和香附油。与化学PE氮酮相比,全方挥发油促渗能力是氮酮的2.5倍,皮肤安全性为氮酮的3.28倍,因此香附四物汤全方挥发油具有作为PE应用的潜力。

“药辅合一”是中药制剂使用辅料的重要原则,蕴含着独特的哲学智慧和用药理念,在中药制剂中具有普遍性[17]。与化学PE不同,中药挥发油由于其成分经皮吸收的性质可以发挥药理效应。李钰等[5]以桂皮醛为指标,考察了肉桂油中桂皮醛及桂皮醛单体的体外经皮吸收行为,发现桂皮醛在肉桂油中的渗透性更强。藁本内酯是多种挥发油中的共有成分,具有显著的镇痛、抗炎药理活性[18],其适宜的相对分子质量,适中的油水分配系数以及较好的溶解度,利于其在外用制剂中的透皮吸收[19]。在同等剂量下,全方挥发油对离体子宫收缩的抑制作用明显优于各组方药材挥发油,强于Ca2+通道阻滞剂维拉帕米,提示选择其作为PE应用于香附四物汤经皮外用制剂除了促进其他药效成分的透皮吸收,自身也能直接产生较强的药理作用,具有“药辅合一”的特点。

通过GC-MS分析发现,全方挥发油与组方药材挥发油相比共产生了16种新成分,虽然与川芎油共有成分种类最多,主要成分藁本内酯的含量相当(分别为45.54%和38.69%),但其促渗作用为川芎油的1.29倍(K电阻比值),对子宫平滑肌抑制作用最强而川芎油未见显著抑制作用,提示7味药材按处方比例共煎提取,可能发生了一系列的物理或化学变化[20]。在配伍作为PE应用时,不同挥发油可能体现协同作用,比如香附油和川芎油主要降低皮肤屏障,促进其他挥发油(如当归油)或其他药理活性强的成分透皮发挥效应。因此全方提取的挥发油较4种组方药材挥发油显示出增效(促渗效果强和药理活性强)的趋势,更易发挥“药辅合一”作用,在一定程度上阐明了香附四物汤配伍应用的科学性和必要性。

皮肤电阻法早已广泛用于离体皮肤屏障功能的评价[15,21],以及PE的筛选[22]。本文应用市售细胞电阻仪结合Transwell小室进行皮肤电阻值的测定,课题组前期应用该套装置评价了温里药挥发油对皮肤屏障作用的影响,并与Franz扩散池法对挥发油促渗香附四物汤中不同极性成分透皮效果进行比较,发现两种方法对挥发油PE促渗不同极性成分的评价结果具有明显的相关性(R2=0.748 1～0.812 9)[23],证明皮肤电阻技术可以代替渗透实验评价PE促渗能力。本文应用皮肤电阻法评价香附四物汤提取的挥发油的透皮促渗能力,可以排除被促渗药物性质的干扰。目前仍有90%挥发油尚未作为PE开发,通过药对或配伍还可能极大丰富挥发油PE种类,皮肤电阻法具有高通量筛选的优点,可提高中药挥发油PE开发和应用的效率,充分利用好和发展好中药挥发油的资源宝库。