核桃JrCOR413 基因家族鉴定与表达分析

刘 凯，李瑶玲，李 洋，王红霞，赵书岗，安秀红，张志华

（1.河北农业大学 园艺学院，河北 保定 071001；2. 河北农业大学 山区研究所/河北省农业工程中心/国家北方山区工程中心，河北 保定 071001；3.河北农业大学 生命科学学院，河北 保定 071001；4.河北省农林科学院 植物保护研究所，河北 保定 071001）

核桃（Juglans regiaL.）是世界著名的“四大坚果”之一，栽培历史悠久，是我国的重要经济树种，但非生物胁迫严重影响着核桃正常的生长发育［1］。冷适应蛋白(cold-regulated, COR)基因家族是植物中所特有家族，包括COR6、COR15A、COR47、COR413等成员，COR413首次在拟南芥响应低温胁迫过程中发现［2］。该家族根据定位不同分为2 个亚组，分别是定位于细胞膜（PM）和类囊体膜蛋白（TM）［3］。有多项研究表明，COR413基因受低温胁迫诱导表达，并且参与到响应低温过程中［4-6］。目前COR413基因在响应低温胁迫过程中的角色逐渐清晰，先后在拟南芥［7］、山葡萄［3］、丹参［8］、油菜［9］、小立碗藓［10］等多种植物中发现COR413基因家族成员。王鹏洋等指出油菜FmCOR413［11］基因表达的节律性与低温耐受性相关联，在夜晚与低温情况下表达量显著升高。丁小玲等［3］研究表明山葡萄4 个COR413s家族成员基因有不同程度的响应低温胁迫。多项研究表明COR413 基因家族成员广泛参与到植物响应冷胁迫中，但在核桃中对COR413 基因家族进行鉴定和分析尚未见报道。本研究基于最新核桃基因组中鉴定JrCOR413 基因家族成员，并对其进行综合分析，并分析其家族成员在冷胁迫与不同组织中的转录表达分析，为解析核桃JrCOR413 基因家族成员在响应低温胁迫过程中的分子机制研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与处理

供试材料核桃(Juglans regiaL.)为同一株实生砧木上同时嫁接‘辽8’和‘清香’，2 年生苗。整株进行冷胁迫（0.5 ℃）处理48 h，未低温处理为对照。采集叶片液氮速冻。不同组织（根、嫩茎、嫩叶、雄花、雌花、老叶）均采自河北农业大学标本园‘清香’核桃，采集后液氮速冻，送至北京诺禾致源科技股份有限公司用于RNA-Seq 测序，3 次重复。

JrCOR5表达分析为盆栽2 年生‘清香’核桃。整株进行冷胁迫处理4、8、12、24、36、48 h，采集后液氮速冻，用于RNA 提取并反转录为模板，进行qPCR 表达分析（试剂来源天根生化有限公司，货号DP441、KP108-01、FP205）。

1.2 核桃JrCOR413 基因家族分析

拟南芥JrCOR413 家族成员序列来自于uniport（https://www.uniprot.org/）蛋白序列，利用生物信息方法［12］于核桃参考基因组GCF_001411555.2中挖掘鉴定JrCOR413。利用PFAM 蛋白质家族数据库（http://pfam.xfam.org/）分析保守结构域，利用在线分析工具Gene Structure Display Server 2.0（http://gsds.gao-lab.org/） 和Multiple Em for Motif Elicitation（http://meme-suite.org/） 对 核 桃JrCOR413 家族基因进行基因结构和保守基序分析。利用MEGA X 软件构建核桃和拟南芥COR413 家族成员的系统发生树，方法为Neighbour-Joining，Bootstrap 值为1 000。

1.3 核桃JrCOR413 基因的生物信息学分析

分别利用NCBI 上的ORF Finder (https://www.ncbi.nlm.nih. gov/orffnder/)、ExPASy (https://web. expasy.org/ protparam/)、NetPhos 3.1 Serve（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）、Net NGlyc 1.0 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/）、SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org）、Plantcare（http://bioinformatics. psb.ugent.be/webtools/ plantcare/html/）分析家族成员的开放阅读框、蛋白的结构、糖基化和磷酸化位点、3D 结构及启动子顺式结合元件。

1.4 核桃JrCOR 413 家族基因表达分析

将‘清香’冷处理4、8、12、24、36、48 h 后进行转录表达分析，以 FPKM 为基因表达量衡量标准进行表达分析［13］。对‘清香’的雌花、根、老叶、嫩茎、嫩叶、雄花、芽进行RNA-seq 分析不同组织中的转录表达量，以 FPKM 为基因表达量衡量标准进行表达分析。JrCOR5 表达分析于NCBI 上检索基因序列信息，并利用pick primer 在线设计引物（表1）。反应程序：94 ℃，3 min；94 ℃，30 s；58 ℃，30 s；72 ℃，1 min；72 ℃，1 min；4 ℃，holding。qPCR 反 应 体 系（20 µL）： 含12.5 µL SYBR MIX、1.0 µL cDNA 模板、1.0 µL F Primer、1.0µL R Primer、4.5 µL ddH2O；反应体系：94 ℃，3 min；94 ℃，30 s；55 ℃，30 s；72 ℃，30 min；72 ℃，1 min；4 ℃，holding。试验结果用 2-ΔΔCt法对数据进行定量分析。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

2 结果与分析

2.1 核桃JrCOR413 家族成员挖掘与分析

2.1.1 核桃JrCOR413 家族成员染色体定位与基因信息分析 将AtCOR413 家族7 个蛋白序列运用Hmmer 3.0 与Pfam 数据库结合等生物信息方法，并利用MEGA X 进行序列比对，鉴定出6 个核桃JrCOR413 家族基因（表2），编码7 条完整的蛋白，分布在4 条染色体（图1），并命名为JrCOR1 ～JrCOR7。在6 个JrCOR413s 中基因长度最短的为1 790 bp，最长的为7 447 bp，开放阅读框长度在549 ～804 bp，翻译得到的JrCOR413 蛋白质的长度均处于182 ～267 个氨基酸之间，分子量在19.74 ～30.04 kD 之间；等电点在8.15 ～9.93之间，7 个蛋白均为碱性；利用ExPasy 进行稳定性预测，结果显示不稳定系数均小于40，该家族成员均为稳定蛋白。

表2 核桃JrCOR 家族成员的基因信息Table 2 Basic information of JrCOR gene family genes from J. regia

图1 核桃 JrCOR 基因染色体定位Fig.1 Mapping of the JrCOR gene family on chromosomes in J. regia

利用ExPasy 将基因的疏水性进行预测（表3），其成员平均疏水性均>0，属于疏水性蛋白。利用Net NGlyc 1.01.0 和NetPhos 3.1Server 分 析 其 家 族成员磷酸化位点和糖基化（表3），7 个JrCOR413蛋白含有8 ～15 个丝氨酸，2 ～9 个苏氨酸，2 ～3个酪氨酸；只有JrCOR2、JrCOR4、JrCOR6 含有1个N-糖基化，并且只有JrCOR4、JrCOR6 含有2 个O-糖基化。

表3 核桃JrCOR 家族蛋白的理化性质Table 3 Basic information of JrCOR gene family from J. regia

2.1.2 核桃JrCOR413 家族多序列比对分析 利用DNAMAN 对核桃JrCOR413 家族7 个蛋白序列进行序列比对并分析其保守结构域（图2），看出核桃7 个家族成员蛋白在10 ～208 aa 之间含有WCOR 结构域，并且具备植物典型的COR413 结构域特点。

图2 核桃JrCOR413 家族成员蛋白序列比对分析Fig.2 Multiple alignment of JrCOR413 family from J. regia

2.2 不同物种 JrCOR413 家族进化树分析

将核桃与拟南芥COR413 家族共14 个蛋白构建系统发育分析（图 3）。结果表明，核桃与拟南芥COR413 家族蛋白同源性较高，并且划分为2 个亚组，一亚组COR413-PM 定位于细胞膜有5 个成员，另一个亚组 COR413- TM 定位于类囊体膜有2 个。

图3 JrCOR413 与AtCOR413 系统发育树分析Fig.3 Phylogenetic tree of JrCOR413 and AtCOR413

2.3 核桃JrCOR413 家族基因结构、保守基序与3D 结构分析

为进一步研究核桃JrCOR413 基因进化，对其基因结构与保守基序进行分析（图4）。结果表明，核桃JrCOR413 家族成员都包含由4 ～6 个外显子不等，亚组1 中5 个成员均含有4 个外显子，亚组2 含均有5 个内含子；核桃JrCOR413 存在相同的保守基序motif 1 与motif 2；在相同亚组成员蛋白序列中保守基序分布具有极高的相似度，亚组2 中2个蛋白含有特有的保守基序motif 5。通过SWISSMODEL 进行该基因家族蛋白3D 结构预测（图5），结果表明7 个蛋白成员呈现不同的3D 结构。

图4 核桃JrCOR413 家族成员基因结构与保守基序Fig.4 Gene structure and Conserved motif analysis of JrCOR413 family from J. regia

图5 核桃JrCOR413 家族成员蛋白3D 结构预测Fig.5 3D structure prediction of JrCOR413 family

2.4 核桃JrCOR413 家族基因启动子元件分析

利用Plantcare 对核桃JrCOR413 基因家族成员起始密码子上游1 800 bp 启动子区作用元件进行分析（图6），核桃JrCOR413 基因家族成员启动子区存在多个激素（水杨酸、茉莉酸、乙烯、赤霉素等）信号和响应胁迫（干旱、低温、应激和防御等）调控元件，并且含有多个转录因子（bHLH TFs：G-box，MYB TFs：MYB binding site 等）结合元件，特别是JrCOR3 和JrCOR7 含有LTR 元件，因此推测该成员与核桃响应低温胁迫相关。

图6 核桃JrJrCOR 启动子区元件分布Fig.6 Elements in the promoter region of JrCOR genes

2.5 核桃JrCOR413 基因家族成员表达分析

将同一砧木嫁接‘辽宁8 号’和‘清香’，进行0.5 ℃冷处理48 h 的RNA-seq 结果表明，核桃JrCOR413 家族7 个基因出现不同的响应（图7）。在12 个RNA 文库中，只有JrCOR5同时出现了显著上升的表达，其他基因变化不显著。通过不同组织转录表达分析，JrCOR5在花器官和嫩茎中表达较高，特别是雄花表达最高；JrCOR7在雄花中表达较高。进一步通过‘清香’冷处理4、8、12、24、36、48 h 后进行qPCR 分析（图8），发现冷胁迫4 h 出现显著上升后下降，直至48 h 出现高峰，为对照90 倍左右，与转录组数据变化趋势一致，验证了转录组数据的准确性。

图7 核桃JrCOR 基因家族成员转录表达分析热图Fig. 7 Heat map of JrCOR413 gene expression obtained from RNA-seq in Juglans regia L.

图8 核桃JrCOR5 基因在冷胁迫不同时间的相对表达Fig. 8 Relative expression of JrCOR5 gene at different times of cold stress

3 结论与讨论

COR 基因在植物响应低温胁迫中扮演着重要角色［14］。目前测序技术的发展促进了植物的COR413的鉴定与分析，在山葡萄中发现4 个［3］，在甘蓝型油菜、白菜和甘蓝中分别鉴定到11、6 和6 个COR413 基因［9］等，本研究通过生物信息学于核桃最新基因组，挖掘并鉴定出6 个核桃COR413 家族基因，编码7 条蛋白，并对其成员进行结构与表达分析，丰富了植物COR413 基因家族种类，将为核桃COR413 基因解析响应低温胁迫分子机制奠定理论基础。

本研究首先对7 个COR413 家族成员蛋白的保守结构域进行预测，核桃7 个家族成员含有典型的WCOR413 高度保守的结构域，可以看出符合COR413 家族类型特点，与水曲柳［11］中FmCOR413 保守结构域研究一致，而且王学娟［15］在山葡萄北冰红冷适应蛋白COR413-I2 也发现了WCOR413 高度保守的结构域。

其次对鉴定的7 个COR413 家族成员的外显子-内含子结构、保守基序进行预测。核桃COR413家族成员都包含有4 ～6 个内含子不等；核桃COR413 家族存在共同的motif 1 和motif 2，在2 个亚组内具有极高的相似度；而且亚组2 中含有自己特有的保守基序，如motif 5，研究结果与山葡萄［3］COR413 蛋白保守基序分析结果研究一致。而且本研究对核桃与拟南芥COR413 家族共14 个蛋白构建系统发育树，研究结果表明7 个核桃被分成TM 与PM 2 个亚组，在拟南芥［2］与山葡萄［3］4 个成员中也被分成了2 个亚组。本研究分析核桃6 个基因上游1 800 bp 启动子区域中存在的结合元件，6 个核桃COR413 启动子区域含有多个胁迫和激素响应结合位点，并且含有低温响应元件，证实与响应低温胁迫有密切关系。

已有研究证实COR 基因能够响应低温胁迫。金新开等［16］研究表明AtCOR15a异源表达能够显著增强转基因番茄的耐寒性。林强等［17］为验证播娘蒿抗寒基因DsCOR的抗寒功能，通过农杆菌介导花序浸染法终验证了抗寒基因DsCOR的抗寒功能，并且在山葡萄［3］、油菜［9］和水曲柳［11］中COR413基因能够不同程度的响应低温胁迫。本研究通过将同一砧木嫁接‘辽宁8 号’和‘清香’，进行0.5 ℃冷处理48 h，进行转录组测序，发现冷胁迫48 h，核桃JrCOR5转录水平显著升高，并通过qPCR 进一步说明了JrCOR5能够响应低温胁迫。将为揭示核桃COR413 基因响应冷胁迫机理奠定基础。