附加生长延缓剂和无菌水覆盖延长葡萄试管苗继代间隔的研究

刘文林，成晓华，杜国强，王 莉，师校欣

(河北农业大学 园艺学院，河北 保定 071001)

丰富的植物种质资源为植物育种和遗传研究提供了广泛的遗传基础［1］。利用组织培养技术离体保存种质资源可以克服资源圃保存的诸多弊病，具有所占空间小、基因型稳定、不受季节限制、恢复生长快、便于运输和交流等优点。葡萄种质资源离体保存，最好进行限制生长保存，通过延缓试管苗生长，延长继代间隔时间，减少试管苗接种的工作量，降低变异机率［2］。

多效唑（PP333）、比久（B9）、矮壮素（CCC）、脱落酸（ABA）、马来酰肼（MH）等生长延缓物质应用于植物组织培养技术，在延缓生长、壮苗培养等方面取得了良好效果［3］。常腾飞等［4］研究表明B9、CCC、PP333 可延长‘富士’‘乔纳金’苹果试管苗保存时间；在培养基中添加适宜浓度的PP333、ABA 和B9，并结合不同光照和温度培养条件，有效延长了芋头试管苗的保存时间［5］；培养基附加 PP333 有效抑制了‘Melissa’‘巨玫瑰’葡萄试管苗生长，可用于该葡萄品种种质离体保存［6］。近年来，众多研究者开始试验一些新型的植物生长延缓剂，为试管种质离体保存提供更多更好选择［7］。烯效唑（S3307）与多效唑结构相似，活性是多效唑的6 ～10 倍，高效、低毒、残留量小、不污染环境，应用前景更广［8］。在脚板薯组织培养中，培养基中附加烯效唑促进了丛生芽分化生长，使节间缩短、茎段粗壮［9］。在培养基中添加烯效唑对青钱柳试管苗的生长和生理特性,有良好作用［10］。于弋珺等［11］试验证明，烯效唑可显著抑制马铃薯试管苗生长，延长继代间隔时间，又可以利用KT 与 IBA，迅速解除烯效唑的抑制作用。缩节胺（DPC）也是一种有效的生长延缓剂，可以使植物节间缩短，植株变矮。华婧等［12］研究发现添加100 mg/L 缩节胺可使马铃薯试管苗生长缓慢，顶端生长受抑强烈。这2 种生长延缓剂在葡萄品种试管苗离体保存中均未见应用报道。

在种质离体保存过程中，试管苗生存的养分和水分来源于培养基，试管苗保存时间短的一个重要因素是培养基干涸。Caplin 提出在培养基表面覆盖矿物油能抑制植物养分消耗，降低生长速度，延长植物保存时间［13］，这种方式已应用于香蕉和假马齿苋等植物试管苗离体保存［14-15］。考虑到覆盖矿物油成本较高，本研究通过在培养基表面覆盖无菌水，降低材料周围的氧气浓度，抑制试管苗生长及培养基水分蒸发，并结合附加烯效唑处理，期望达到延缓葡萄试管苗生长，减少培养基水分蒸发，延长种质离体保存时间的良好效果。

1 材料与方法

1.1 材料

供试葡萄品种为‘巨峰’（‘Kyoho’）、‘赤霞珠’（‘Cabernet Sauvignon’）、‘四倍体玫瑰香’（‘Tetraploid Muscat Hamburg’）、‘克瑞森无核’（‘Crimson Seedless’），试验于2016 年10 月—2018 年4 月在河北农业大学园艺学院生物技术实验室进行。

1.2 方法

1.2.1 继代培养基及常规培养条件 继代培养基：B5+IAA 0.5 mg/L+白砂糖25 g/L+琼脂6.0 g/L，pH值为6.0。常规培养条件：室温25 ℃，光照强度为2 000 Lx，光周期为（光/暗）14 h /10 h。

1.2.2 培养基附加缩节胺对葡萄试管苗生长的影响 在继代培养基中附加不同浓度的缩节胺，浓度设 置 为0、150、200、250、300、400、500、600、800、1 000 mg/L；试验接种材料为（1.5±0.1）cm 不带叶片的单芽茎段。采用完全随机试验设计，每处理6 瓶，每瓶接5 个茎段，重复3 次（下同）。每隔30 d 对试管苗的存活率进行调查。

1.2.3 培养基附加烯效唑对葡萄试管苗生长的影响 在继代培养基中附加不同浓度的烯效唑，浓度设置为0、0.5、1.0、2.0、4.0 mg/L。每隔30 d 对试管苗的株高及存活率进行统计。

1.2.4 培养基表面覆盖无菌水对葡萄试管苗生长的影响 茎段接种后即在培养基表面覆盖无菌水。无菌水的体积设置为0、20、40、60、80 mL，并对液面做好标记。每隔30 d 对试管苗的株高和存活率进行统计。

1.2.5 培养基附加烯效唑及表面覆盖无菌水对葡萄试管苗生长的影响 将葡萄无叶单芽茎段接种在附加1.0 mg/L 烯效唑的培养基中，再覆盖0、20、40、60、80 mL 无菌水。每隔60 d 对试管苗的株高和存活率进行统计。

1.2.6 恢复生长 将以上处理的葡萄试管苗延缓生长180 d 后转接到继代培养基上常规培养。

1.3 数据调查

存活率（%）= 存活株数 / 接种数 × 100

株高为培养基表面以上部分的植株高度，试管苗生长至8.5 cm 达到封口膜后弯曲生长，无法精确测量其高度，最终高度以≥ 8.5 cm 表示。

1.4 统计分析

利用Excel、DPS 数据处理系统12.01 版对数据进行处理及方差分析（多重比较采用邓肯新复极差测验），百分率数据进行了反正弦平方根转换。

2 结果与分析

2.1 培养基附加缩节胺对葡萄试管苗生长的影响

培养基附加不同浓度的缩节胺，对‘巨峰’‘赤霞珠’葡萄试管苗的萌芽率和生根率无明显影响，但能显著抑制葡萄试管苗植株高度，且浓度越高，抑制生长作用越明显。缩节胺浓度800 和1 000 mg/L 时，试管苗的茎、叶畸形严重，不适于作为延缓试管苗生长的适宜浓度。缩节胺对葡萄试管苗存活率的影响如表1 所示，‘巨峰’葡萄试管苗保存至180 d 时，200 ～250 mg/L 缩节胺处理的存活率虽高于对照，但仅达到10.0%～14.4%，故缩节胺不适宜‘巨峰’等葡萄延缓生长保存（其它不适宜品种‘四倍体玫瑰香’‘克瑞森无核’的数据略）。附加250 mg/L缩节胺处理的‘赤霞珠’试管苗保存180 d 的存活率100%，显著高于其它处理，因此培养基附加250 mg/L 的缩节胺可用于‘赤霞珠’试管苗延缓生长保存（表1）。

表1 培养基附加不同浓度缩节胺对‘巨峰’和‘赤霞珠’葡萄试管苗存活率的影响Table 1 The effect of supplying Mepiquat Chloride in the media on the survival rate of ‘Kyoho’ and‘Cabernet Sauvignon’ grape plantlets in vitro

2.2 培养基附加烯效唑对葡萄试管苗生长的影响

将‘巨峰’‘四倍体玫瑰香’‘克瑞森无核’葡萄试管苗接种于附加0、0.5、1.0、2.0 和4.0 mg/L 烯效唑的培养基中，观察不同浓度烯效唑对试管苗生长的影响，结果如图1 所示，附加低浓度的烯效唑显著抑制了‘巨峰’‘四倍体玫瑰香’和‘克瑞森无核’试管苗生长，可将试管苗顶端干枯时间分别延迟30 ～90 d，过高浓度的烯效唑对试管苗的抑制作用太强，致使长时间保存存活率降低，‘克瑞森无核’品种虽在2.0 mg/L 浓度下存活率最高，但试管苗根系过于粗壮，茎叶卷缩、颜色异常，不宜采用。附加0.5 mg/L 烯效唑时，有效延长了‘巨峰’‘四倍体玫瑰香’和‘克瑞森无核’试管苗保存时间，保存180 d 时，3 个品种试管苗的存活率分别为50%、45%、67%，而对照仅能保存120 d；附加1.0 mg/L 烯效唑时，也能在180 d 时保持较高存活率，与0.5 mg/L烯效唑处理差异不显著。为此，在培养基中附加0.5 ～1.0 mg/L 的烯效唑对延长葡萄试管苗继代间隔时间有良好作用。

图1 培养基附加烯效唑对葡萄试管苗生长的影响Fig.1 The effect of supplying Uniconazole in the media on the growth of grape plantlets in vitro

2.3 培养基表面覆盖无菌水对葡萄试管苗生长的影响

将‘巨峰’‘四倍体玫瑰香’‘克瑞森无核’葡萄试管嫩梢去掉叶片，切分成约1.5 cm 的单芽茎段，接入培养基中，随即在培养基表面倒入不同体积的无菌水，结果表明（图2、3），覆盖无菌水初期有一定的推迟茎段萌芽、抑制生长作用，同时出现‘玻璃化’现象，但是当植株生长露出水面后，嫩梢和叶片可恢复正常，后期生长量与对照差异不显著。随培养时间延长，覆盖无菌水处理有效抑制了培养基水分蒸发，延长了葡萄试管苗的保存时间。由于加水量增加，试管苗叶片腐烂程度加重，从试管苗状态及抑制培养基水分蒸发综合考虑，适宜的覆盖水量为20 ～40 mL。

图2 培养基表面覆盖不同体积无菌水对葡萄试管苗生长的影响Fig.2 The effect of covering different amount sterile water on the medium surface on the growth of the grape plantlets in vitro

图3 培养基覆盖不同体积无菌水的‘巨峰’葡萄试管苗生长状态（120 d）Fig.3 The growth status of the 'Kyoho' grape plantlets in vitro on the media that covered with different amount of sterile water (120 d)

2.4 培养基附加烯效唑同时表面覆盖无菌水对葡萄试管苗生长的影响

限制试管苗保存时间的一个重要因素是随着培养时间的延长，培养基逐渐干涸，为了更好抑制试管苗生长和培养基水分蒸发，进行了培养基中附加1.0 mg/L 烯效唑同时覆盖不同体积无菌水的试验。结果表明，该组合处理能够有效推迟‘巨峰’‘四倍体玫瑰香’‘克瑞森无核’无叶茎段腋芽萌发及不定根的发生时间，且加水量越多，抑制作用越明显（数据略）。浸没在水中的茎段萌芽后易‘玻璃化’，随株高增加，试管苗逐渐露出水面，后期新长出的茎叶逐渐恢复正常。

培养基附加1.0 mg/L 烯效唑及表面覆盖20～80 mL无菌水的组合处理有效延长了‘巨峰’‘四倍体玫瑰香’和‘克瑞森无核’试管苗保存时间，保存180 d 时，3 个品种的试管苗存活率分别由只加烯效唑单一处理的55%、50%、70%提高到组合处理的100%。从存活率、生长状态及玻璃苗发生情况考虑，建议在附加烯效唑的培养基上覆盖40 mL 无菌水（图4、5）。

图4 培养基附加烯效唑及表面覆盖无菌水对葡萄试管苗生长的影响Fig.4 The effect of supplying Uniconazole in the medium and covering sterile water on the medium on the growth of the grape plantlets in vitro

图5 附加烯效唑及覆盖无菌水对‘巨峰’葡萄试管苗生长的影响（180 d）Fig.5 The effect of supplying Uniconazole and covering sterile water on the growth of the 'Kyoho' grape plantlets in vitro (180 d)

2.5 恢复生长

将培养基附加缩节胺处理的‘赤霞珠’试管苗、附加烯效唑处理以及附加烯效唑同时覆盖无菌水处理的‘巨峰’‘四倍体玫瑰香’及‘克瑞森无核’试管苗延缓生长180 d 后转接到普通继代培养基上常规培养。

培养基附加缩节胺处理的葡萄试管苗在第1 代均能恢复正常生长。附加烯效唑处理的试管苗在第1 代普遍恢复效果不好，第2 代恢复正常，在植株形态及生长量方面与对照相比无显著性差异。培养基附加烯效唑及表面覆盖无菌水处理的试管苗恢复效果依品种而异，大部分根系有增粗的现象，‘巨峰’品种在第1 代即恢复生长；‘四倍体玫瑰香’与‘克瑞森无核’在第1 代恢复效果不好，第2 代恢复正常。推测是烯效唑在不同品种试管苗中的残留效应不同导致（图6）。

图6 恢复生长培养的试管苗（第1 代）Fig.6 The plantlets in vitro grew in conventional medium (First subculture stage)

3 讨论与结论

缩节胺、烯效唑是一类植物内源激素赤霉素（GA）的拮抗物质，它们能够抑制赤霉素合成通路中某些基因的表达，从而抑制赤霉素的合成，延缓植物生长，外施赤霉素类似物后植株就能恢复正常［16-17］。缩节胺常用于马铃薯组培中，主要目的为壮苗及诱导试管薯等［18-19］。本研究表明，缩节胺对葡萄试管苗延缓生长保存的效果因品种而异，‘巨峰’‘四倍体玫瑰香’和‘克瑞森无核’等试管苗不适宜，培养基中附加250 mg/L 的缩节胺对‘赤霞珠’试管苗延缓生长有较好作用。这与不同基因型马铃薯试管苗对缩节胺浓度敏感性存在差异的结果类似［12］。其原因推测可能是不同葡萄基因型对缩节胺的敏感性不同，另外与赤霉素有多条合成途径有关，缩节胺对每条赤霉素合成途径的抑制作用可能存在差异。

烯效唑作为一种高活性植物生长延缓剂，具有延缓植物生长、促根壮苗、增强抗逆性等作用。潘学军等在培养基添加0.1 mg/L 的烯效唑结合低温、弱光培养在野生毛葡萄试管苗离体保存中取得良好效果；同时研究表明适宜的烯效唑等处理增加了试管苗叶肉细胞的紧密度，提高了试管苗的保护酶和可溶性蛋白含量即提高了抗氧化能力，是烯效唑用于离体保存成功的重要机制之一［20］。但不同的植物种类及不同的试管材料应用时适宜的烯效唑浓度存在差异。周恒等［21］研究显示适合草莓试管苗种质保存的烯效唑浓度为0.1 mg/L，超过0.15 ～0.20 mg/ L 时，试管苗多数死亡。培养基添加6 mg /L烯效唑，可将木薯胚性愈伤组织的继代时间由20 d延长至80 d［22］。本研究结果表明在培养基中附加0.5 ～1.0 mg/L 的烯效唑可有效抑制葡萄试管苗生长，适于离体种质保存。

本研究筛选出的适宜烯效唑处理虽然能有效延缓试管苗生长，但由于常温下培养基中的水分蒸发，培养基干涸造成试管苗死亡，导致延长葡萄试管苗继代间隔时间的效果并不十分理想，为此本研究创造性地进行了培养基附加烯效唑同时覆盖无菌水的处理。在培养基表面覆盖无菌水的方法至今未见报道，一般认为植物长期浸泡于水中或涝渍胁迫下进行无氧呼吸，大量消耗可溶性糖，积累有毒化合物，影响植物正常生长［23-24］；另外一个限制因素是试管苗覆盖在无菌水中会出现‘玻璃苗’，本团队进行葡萄和其它果树及花卉覆盖无菌水的试验都会遇到这个问题，但葡萄有别于其它植物的特点是培养基中未加细胞分裂素6-BA（6-BA 与‘玻璃苗’发生有关），这样玻璃化程度较轻，且植株长势高，随着保存时间的延长，植株慢慢露出水面，水对植物的影响作用逐渐降低，长出水面的葡萄试管苗即可恢复正常，对植株存活率没有明显影响。而其它植物继代培养基中加有6-BA，‘玻璃苗’本身发生严重，且多为丛芽增殖，不同于葡萄试管苗后期能长出水面，因此很难恢复正常。培养基中覆盖20 ～40 mL无菌水对延长葡萄试管苗保存时间有独特优势，延缓生长保存中将延缓剂与覆盖无菌水的组合处理比单一处理效果更好。在无菌水蒸干之后向培养基表面继续附加无菌水或营养液的方法值得进一步研究。