铁死亡机制及其在血管性认知障碍中的作用

张钰涵，苏凯奇，刘 昊综述，冯晓东审校

0 引 言

血管性认知障碍(vascular cognitive impairment, VCI)是一种由血管性疾病和血管危险因素引起的，以认知缺陷、行为障碍以及生活能力下降为主要临床表现的综合征，严重威胁人类健康，给社会医疗系统带来沉重负担。国内研究报道[1]，中国65岁以上老年群体中VCI发病率约为8.7%。加拿大健康与老龄化研究报道[2]，65～84岁受访群体中轻度VCI的发病率高于血管性痴呆(vascular dementia，VD)，且VCI患者有较高的入院率和死亡率。近年来VCI的发病机制成为研究热点。目前已知除血脑屏障破坏、清除障碍、神经细胞变性等是VCI的潜在发病机制外，各种脑血管性疾病导致的神经元细胞的损伤是VCI的主要原因[3]。铁死亡是一种新的细胞死亡形式，铁代谢异常以及脂质过氧化物的积累可促进神经元细胞的死亡。研究表明，在神经退行性疾病中使用铁死亡抑制剂可延缓疾病进展[4]。然而，铁死亡相关研究仍处于发展早期，有很多问题亟待解决。因此，笔者对铁死亡的提出、特点以及调控机制进行概述，并讨论了铁死亡与VCI之间的密切关系，为后续铁死亡的研究以及VCI的治疗提供新思路。

1 铁死亡的概述

1.1 铁死亡的提出及其主要特征2003年，Dolmsy等[5]首次发现了一种可诱导肿瘤细胞发生非凋亡形式死亡的化合物，即麦角素(Erastin)。2008年，Yang等[6]再次发现了一种可诱导细胞铁依赖性死亡的化合物，即两种Ras选择性的致死小分子化合物(RSL3和RSL5)。2012年，Dixon等[7]将由Erastin、RSL3和RSL5触发的铁依赖性新型细胞死亡方式称为“铁死亡”。铁死亡的形态学特征主要是细胞肿胀，线粒体缩小，线粒体膜密度增加，外膜破裂，线粒体嵴减少或消失以及线粒体膜电位下降。生化特征主要是铁及脂质活性氧(lipid reactive oxygen species，LROS)诱导的脂质过氧化物(lipid peroxides,LPO)的大量积累，谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4, GPX4)和谷胱甘肽(reduced glutathione, GSH)等铁死亡抑制剂的耗尽[8]。遗传学上，主要是由铁稳态和脂质代谢介导的多基因调控的过程，但具体机制有待研究[9]。由于细胞铁依赖性死亡表现出独特的形态学、生化学和遗传学等特征，将自身与传统的调节性细胞死亡区分开来。那么如何诱导和抑制铁死亡，有哪些具体化合物，他们的作用靶点是什么，这些问题已经成为近年来的研究热点。

1.2 铁死亡的诱导剂和抑制剂

1.2.1 铁死亡诱导剂目前研究确定了两种细胞成分与铁死亡密切相关：系统xc-胱氨酸/谷氨酸逆向转运蛋白和GPX4。化合物Erastin和RSL3作为铁死亡的主要诱导剂，通过抑制这两种成分来诱导铁死亡[10]。系统xc-是一种氨基酸反向转运蛋白，广泛分布于磷脂双分子层中，其是GSH合成的重要转运体。Erastin直接抑制xc-系统的活性，导致胞内谷氨酸堆积，影响GSH的合成，间接引起GPX4活性减弱，造成铁死亡[11]。GPX4作为哺乳动物中抗氧化的硒蛋白，是铁死亡的关键调节因子，可催化有毒的脂质氢过氧化物还原为脂醇[12]。研究发现，RSL3可直接降低GPX4活性，导致有毒脂质过氧化，引起铁死亡[13]。此外，有文献报道，抑癌基因p53可通过抑制xc-系统的组成亚基SLC7A11的表达，从而导致xc-系统活性降低，诱导铁死亡[14]。总的来说，直接或间接抑制抗氧化防御酶GPX4的活性可引发铁死亡。但是有证据表明GPX4并非触发铁死亡的必备因素，Bersuker和Doll等[15-16]提出FSP1-CoQ10-NAD(P)H信号传导系统，其与GSH-GPX4通路平行作用。铁死亡抑制蛋白1(ferroptosis suppressor protein-1，FSP1)作为一种氧化还原酶，药理学靶向性与GPX4抑制剂强烈协同，在许多癌症实体中抑制FSP1可触发铁死亡。

1.2.2 铁死亡抑制剂铁死亡抑制剂主要是通过抑制铁积累和脂质过氧化的相关通路，来抑制铁死亡。目前常用的铁死亡抑制剂有铁螯合剂(如去铁胺、去铁酮、地拉罗司)、自由基清除剂(ferrostatin-1，Fer-1)和核因子红细胞2相关因子2(nuclear factor erythroid-2 related factor 2，NRF2)等。研究发现，自由基清除剂Fer-1不仅可以减少活性氧(reactive oxygen species，ROS)的积累，而且可以调节氨基酸代谢过程，保护HT-22细胞免受高谷氨酸诱导的兴奋性毒性和铁死亡[4, 17]。铁螯合剂去铁胺(deferoxamine，DFO)可减少铁离子的积累，削弱芬顿反应(Fenton)，缓解ROS积累造成的铁死亡。NRF2是细胞抗氧化系统的基本因子。据文献报道，NRF2一方面促进GSH和GPX4的表达以增强抗氧化系统的功能，另一方面NRF2还可以促进铁输出蛋白(ferroportin 1，FPN1)的表达来减少细胞内铁沉积防止铁死亡，但是关于NRF2的表达在各种研究中仍存在争议[18-19]。除此之外，目前临床使用的铁死亡抑制剂还有抗氧化剂和格列酮类等药物，干扰脂质代谢过程对抗铁死亡。虽然已发现多种铁死亡抑制剂，但是关于这些药物的潜在应用仍需钻探，同时开发铁死亡靶向药并研究联合用药的可行性对临床疾病治疗具有重大意义。

1.3 铁死亡的调控机制铁死亡是一种铁依赖性的新型细胞程序性死亡，其标志是铁诱导的LPO的积累、GSH的耗竭和GPX4的失活，这种不平衡的氧化还原会触发细胞死亡。尽管对铁死亡的确切机制仍知之甚少，但铁死亡的调节与多种生物过程密切相关，主要包括铁、脂质和氨基酸代谢。

1.3.1 铁代谢的调控途径细胞内游离铁是诱导铁死亡的关键。通过专门的运输系统和膜载体的协调平衡，细胞可以控制铁的摄入、排出、储存和转化，维持正常的铁稳态。在铁代谢过程中，铁摄取蛋白和铁输出蛋白FPN1起着至关重要的作用[20]。起初，细胞外游离的三价铁(Fe3+)通过铁摄取蛋白途径进入细胞，在细胞的酸性内体中被前列腺3的六跨膜上皮抗原(six transmembrane epithelial antigens of prostate 3，STEAP3)还原为二价铁(Fe2+)。随后，亚铁离子被二价金属转运蛋白1(divalent metal transporter 1，DMT1)转运到细胞质以满足其代谢需要。最终，过量的铁必须通过铁输出蛋白FPN1输出细胞外。铁输入增加或者铁输出减少，均可导致细胞内Fe2+的积累，诱导铁死亡。此外，自噬也会促使铁死亡。核受体辅激活因子4(nuclear receptor coactivator 4，NCOA4)是一种选择性货物受体，NCOA4与铁蛋白结合形成NCOA4-铁蛋白复合体，随后将其递送至溶酶体进行降解释放出游离铁，增加细胞内铁离子水平，该过程被称为“铁蛋白自噬”[21]。抑制溶酶体功能或者敲除NCOA4基因均可抑制铁蛋白自噬，缓解铁过载，阻止铁死亡[22]。由此可见，控制铁代谢的运输系统和膜载体等任何过程出现异常，均会导致细胞内铁过度积累，诱发细胞铁死亡。但是金属铁如何与受体蛋白结合，是否存在相关通路，过量的铁如何诱发铁死亡等具体分子机制仍待研究。

1.3.2 脂质代谢的调控途径ROS的积累是启动和执行铁死亡的关键环节，脂质氢过氧化物是导致铁死亡的最终执行者。多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid，PUFAs)，特别是花生四烯酸(arachidonic acid，AA)和肾上腺素酸(Adrenoic acid，AdA)，在特殊酶的作用下与磷脂酰乙醇胺(phosphatidyl ethanolamine，PE)反应生成过量的脂质过氧化物导致细胞损伤[23]。AA和AdA复合物先后通过酰基辅酶A合成酶长链家族成员4(acyl-coa synthase long 4，ACSL4)和溶血卵磷脂酰基转移酶3(lysophosphatidylcholine acyltransferase 3，LPCAT3)两步催化生成化合物AA/AdA-PE。ACSL4是5个亚型组成的酶家族成员之一。酶家族成员包括ACSL1、ACSL3、ACSL4、ACSL5和ACSL6，但只有ACSL4专门导致细胞死亡并决定铁死亡敏感性。研究发现，抑制ACSL4有助于抑制铁死亡[24-25]。最终，脂氧合酶(Lipoxygenases, LOXs)将AA/AdA-PE氧化为脂质氢过氧化物PE-AA/AdA-OOH，被确定为铁死亡的细胞死亡信号。据文献报道，使用抗氧化剂(维生素E)可以有效抑制LOXs，从而抑制氢过氧化物的生成进而防止铁死亡[23]。脂质代谢过程中需要多种蛋白分子的参与，如果对清除和抑制生成脂质过氧化物这两个环节进行调控，可有效的对抗铁死亡。

1.3.3 谷胱甘肽代谢的调控途径GSH是由半胱氨酸、谷氨酸和甘氨酸三者以ATP依赖的形式合成的三肽分子。GSH是重要的抗氧化剂，不仅将H2O2转化为H2O，清除自由基，而且作为合成GPX4的辅助因子，将膜脂氢过氧化物还原为脂醇(Lipid alcohol，L-OH)，防止铁死亡。GPX4是独特的抗氧化防御酶和铁死亡的调节因子，可抑制有毒脂质过氧化。然而，GPX4的合成必须使用两分子GSH作为辅助因子。因此，细胞内GSH的水平对GPX4的活性至关重要。GSH的合成主要包括两个步骤：第一，正常情况下细胞外的胱氨酸和细胞内的谷氨酸以1∶1的比例在系统xc-的帮助下进行氧化还原反应，胱氨酸被还原为半胱氨酸。接着半胱氨酸和谷氨酸在g-谷氨酰半胱氨酸连接酶(g-glutamylcysteine ligase，GCL)的催化下形成g-谷氨酰半胱氨酸(g-glutamine cysteine，GluCys)，此过程消耗一分子ATP，其中系统xc-由SLC7A11和SLC3A2 基因编码的两个亚基构成[26]。第二，gGluCys在谷胱甘肽合成酶(glutathione synthetase，GS)的催化下结合甘氨酸形成GSH，此过程亦消耗一分子ATP。由此可见，GSH代谢网络对铁死亡有显著影响。GSH的合成过程如果被干扰，会直接导致GSH水平降低，GPX4活性减弱，有毒脂质氢过氧化物积累，引起铁死亡。除此之外，线粒体在氨基酸代谢失调诱发铁死亡的过程中发挥关键作用。在半胱氨酸剥夺诱导的铁死亡中，可观察到线粒体膜电位短暂超极化，与此同时，线粒体的典型代谢功能促进脂质ROS的产生并加快铁死亡[27]。但是线粒体是否是铁死亡的重要组成部分仍存在很大争议。

2 铁死亡与血管性认知障碍

血管异常是VCI的主要病理，最终导致脑血流量(cerebral blood flow，CBF)的改变。持续降低CBF引发慢性脑灌注不足(chronic cerebral hypoperfusion，CCH)，不仅致使营养物质的供应减少和有害的物质的沉积，还会造成血脑屏障的损害以及神经元的损失，最终表现为认知缺陷[28]。研究发现，铁死亡与神经系统疾病密切相关。在衰老和神经退行性疾病(如AD、帕金森病和亨廷顿病)的实验检测中，海马及基底节等控制认知功能的相关区域，会出现铁离子水平的升高[29-31]。升高的铁离子水平也会加剧神经元细胞的氧化损伤并促进多种病理发生，最终产生明显的认知缺陷[32]。据文献报道，铁死亡抑制剂可显著减少神经系统疾病动物模型中的神经元变性，保护神经元并改善认知功能[33]。新兴研究揭示了铁死亡和VCI之间的紧密联系，提出了铁死亡作为靶点的潜在治疗方法，我们将描述VCI中铁死亡的可能机制。

3 铁死亡调控机制与血管性认知障碍

3.1 铁代谢与血管性认知障碍铁是参与中枢神经系统许多重要生物过程的必需元素，如氧气运输、髓鞘生成以及神经递质的合成及代谢。在神经退行性疾病过程中，神经元铁会逐渐积聚在大脑中。研究表明，铁积聚会导致神经元的损伤和丢失，进而影响认知功能[34]。由此可见，维持细胞内正常的铁稳态对于神经系统疾病的治疗具有重要意义。铁代谢依赖于DMT1和FPN1相互协调。DMT1的表达增加或FPN1的表达降低，均会导致中枢神经细胞对铁吸收增加或铁排泄减少，引发神经元铁的积聚。细胞内过量的铁可通过芬顿反应(Fenton)诱导大量ROS，引发神经元铁死亡并导致认知障碍[26]。此外，铁死亡也与脑卒中密切相关。在脑卒中发生过程中，血脑屏障被破坏的同时，血液中的铁大量沉积于脑实质，导致神经元损伤，诱导神经功能病变。使用铁死亡抑制剂(fer-1、liproxstatin-1)可显著减少中风小鼠动物模型中的脑梗死面积，减少神经元变性并改善认知障碍[35]。综上，铁代谢异常诱导的铁死亡是VCI神经元死亡的潜在因素，但是铁离子过载控制细胞死亡的具体分子机制、触发位点以及如何影响认知功能等问题均需要深入研究。

3.2 脂质代谢与血管性认知障碍血管异常引起的氧化应激已被证明是导致VCI的主要致病机制[36]。LOX和ACSL4是脂质氧化代谢的关键。LOX可通过催化多不饱和脂肪酸引起脂质过氧化，抑制LOX可抑制铁死亡。研究发现，血管异常引发全脑和局灶性脑缺血后，脑组织中12/15-LOX会广泛升高并导致神经细胞铁死亡，抑制12/15-LOX可降低神经细胞死亡程度并改善神经学结果[37]。文献表明，ACSL4在脑组织中广泛表达，尤其是海马CA1区，脑缺血时ACSL4的表达逐渐增加，造成脂质过氧化，诱发Erastin铁死亡。噻唑烷二酮 [例如罗格列酮(ROSI)]是一种治疗糖尿病的药物，可以选择性地抑制 ACSL4 的活性并减轻CCH期间海马神经元的脂质过氧化和氧化应激损伤，保护大脑功能[38]。并且长期服用吡格列酮可以降低非胰岛素依赖型糖尿病患者患痴呆症的风险[39]。由此可以看出，脂质代谢异常是CCH中神经元损伤的一种可能机制，从而导致VCI。

3.3 谷胱甘肽代谢与血管性认知障碍迄今为止，研究人员已经证明氨基酸代谢与VCI有关。GPX4、GSH和xc-系统是氨基酸代谢的关键调节点。GPX4是一种依赖于GSH的过氧化物酶，其是铁死亡的中央调节剂，GPX4失活被认为是铁死亡的执行信号。研究表明，敲除实验动物模型中GPX4基因，其大脑皮层和海马神经元中脂质代谢异常并出现神经元变性，小鼠的认知功能随之下降[40]。GSH的合成需要xc-代谢系统的参与。Xc-系统通过将胱氨酸转运到细胞中合成半胱氨酸，为GSH的合成提供底物。当系统 xc-的功能受损时，半胱氨酸合成减少，GSH减少，GPX4活性降低，造成脂质过氧化物及其降解产物的积聚并诱导铁死亡。此外，谷氨酸是GSH合成的底物之一。在VCI病理机制中，长期的CBF不足导致的CCH可使神经元去极化释放过多的谷氨酸产生兴奋性毒性，破坏神经系统的功能。与此同时，高水平的谷氨酸会抑制xc-系统的功能，影响GSH的生成，促进铁死亡的发生[41]。从以上研究可以看出，氨基酸的代谢与CCH的认知障碍密切相关，但是造成认知障碍的具体通路仍不清楚。

4 结语与展望

自2012年铁死亡的定义被提出以来，对其调控机制和临床应用研究一直是一个热点。在这篇综述中，我们总结了铁死亡的主要机制，并讨论了铁死亡在VCI中的作用。目前已知铁死亡是由铁依赖性积累驱动引起的细胞程序性死亡，其调控机制与铁、脂质和氨基酸代谢密切相关。铁离子和脂质过氧化物的积累是其主要特征。随着铁和脂质过氧化物过载，细胞膜被破坏最终导致细胞死亡。最近证明铁死亡在神经系统疾病(如衰老、神经退行性疾病和脑损伤等)广泛存在，是促进细胞死亡的一种方式。与此同时，一些铁死亡抑制剂如抗氧化剂、铁螯合剂、Fer-1等可改善神经系统疾病的神经元损伤和认知障碍，这大大延缓了疾病的发展进程。在以上论述中我们了解到铁死亡与VCI之间的密切联系。长期脑灌注不足，引发血管异常会促进神经元铁沉积，诱发氧化应激并干扰氨基酸的合成过程导致铁死亡，进而造成认知缺陷。抑制VCI中的铁死亡可以减少神经细胞的死亡并改善认知障碍。因此，铁死亡是VCI中一个有希望的治疗靶点。然而铁死亡的探索仍面临许多问题亟待解决。首先，铁死亡在VCI领域的研究仍处于初级阶段，对其潜在的分子机制仍不清楚。虽然铁过载和脂质过氧化可以引起铁死亡，但其是否参与DMT1、FPN1或铁摄取蛋白等与铁死亡相关的调节靶点需要深入研究。其次，尚无特殊的铁死亡标记物对其过程进行综合广泛的研究，哪些是铁死亡的关键执行分子仍不明确。最后，已知铁代谢异常可引起铁死亡，是否存在其他金属元素诱导铁死亡仍需探讨。进一步研究铁死亡机制及其在疾病中的作用，可为临床疾病的治疗提供新的方向。