斑鸠霉素调节PANC-1细胞系的糖酵解过程

陈 辉，曾陶飞，厉泽宇，王怀涛，周 磊，谭晓冬

0 引 言

胰腺癌仍然是非常具有挑战性的严重威胁人类生命健康的恶性疾病，因其特殊的解剖位置使得胰腺癌的早期发现、早期诊断异常困难，手术切除的机会微乎其微，因而呈现出高致死率。尽管胰腺癌的治疗策略已经发生了显著的改变，但是令人失望的是胰腺癌的5年生存率仅为9%，是所有癌症中最低的[1- 3]。

测序技术的发展吹响了生物信息学研究的号角，现如今，生物信息学研究已经和生物医学研究紧密相连，对后者起到引导，补充和拓展的作用，具有改变传统生物医学研究方式的趋势，引领生物医学研究向着更加精细的方向进展。The Gene Expression Omnibus (GEO)数据库，是生物信息学研究者的福音，收藏有无限的高通量芯片、二代测序功能基因组数据，而这些数据的潜能仍未被充分挖掘，具有巨大的分析价值[4]。

在该研究中，我们分析了依古霉素处理PANC-1细胞系后的基因表达测序数据，获取DEGs，并对DEGs进行进行GO富集分析和KEGG信号通路富集分析，同时绘制PPI并获得10个hub基因，其中有6个hub基因与胰腺癌的生存预后相关，我们预测DDIT3或LOX可能是斑鸠霉素影响胰腺癌糖酵解过程的靶点。该研究可能为斑鸠霉素抑制胰腺癌的机制提供新的视角。

1 材料与方法

1.1 识别DEGs从GEO数据库中下载GSE120713数据集，平台为GPL17077。使用R软件(version：4.0.3)的“Limma”软件包研究mRNA的差异表达。为了纠正假阳性结果，TCGA或GTEx中分析了调整后的P值，箱线图通过R软件包“ggplot2”进行绘制。“P-Value<0.01且log2(FoldChange)的绝对值>1”被定义为筛选mRNA差异表达的阈值。接下来，根据Fold change和P值绘制火山图，表达热图通过R软件包“pheatmap”进行绘制。

1.2功能富集为了进一步确认潜在基因的潜在功能，通过功能富集对数据进行了分析。基因本体论(GO)受到广泛的使用，用于注释具有功能的基因，尤其是分子功能(MF)，生物途径(BP)和细胞成分(CC)。KEGG富集分析是实用的可用于分析基因功能以及相关的高级基因组功能信息。为了更好地了解目标基因的致癌作用，R中的“ClusterProfiler”程序包被用于分析潜在mRNA的GO功能并丰富KEGG途径[5]。

1.3PPI的构建为了进一步了解潜在基因之间的相互联系，通过STRING(version 11.0)在线工具对DEGs进行了分析。STRING被设计用于计算蛋白与蛋白之间的相互作用，并形成蛋白质相互作用网络。该研究中，将最低互动得分设置为0.15，将无相关连接的蛋白质隐藏。将结果导入Cytoscape软件(version 3.7.2)进行可视化， Cytohubba插件被用来获取hub基因，选择计算MCC得分并进行排序，取前10位的基因作为hub基因。

1.4验证关键基因为了了解上述筛选到的关键基因在胰腺癌中的表达及生存预后情况，GEPIA2在线工具被用来验证关键基因在胰腺癌中的表达情况，GEPIA2匹配TCGA 和GTEx数据库中的正常样本数据，Kaplan-Meier Plotter在线数据库被用来查看关键基因对PDAC生存预后的影响，该数据库中含有PDAC病例177例。

2 结 果

2.1 识别DEGs数据集GSE120713总共含有9个样本，其中3个为未给与斑鸠霉素治疗的PANC-1样本，作为对照组，3个为500 nmol/L治疗的PANC-1样本，作为低浓度治疗组，最后3个为1.5 μmol/L处理的PANC-1样本，作为高浓度治疗组，将低浓度治疗组和高浓度治疗组分别与对照组进行对比分析，获取DEGs。“Limma”包识别出低浓度治疗后共有303个DEGs，高浓度治疗后共有1909个DEGs，两者取交集，共有257基因在高低浓度处理中均差异表达低浓度处理组DEGs的火山图和热图。见图1、图2。高浓度处理组DEGs的火山图和热图。见图3、图4。

图1 低浓度(500 nmol/L)治疗后DEGs火山图

图 2 低浓度(500 nmol/L)治疗后DEGs热图

图3 高浓度(1.5 μmol/L)治疗后DEGs火山图

2.2功能富集分别对低浓度和高浓度的上调和下调的DEGs进行GO和KEGG富集分析，富集结果中P<0.05 或 FDR<0.05认为富集到有意义的通路。低浓度组富集情况见图5。上调的DEGs富集的KEGG条目有cGMP-PKG信号通路等，富集的GO条目为：封存肌动蛋白单体等；而下调的DEGs富集的KEGG条目包括：p53信号通路等，富集的GO条目为维生素的生物合成过程等。高浓度组富集情况见图6。上调的DEGs富集的KEGG条目为Wnt信号通路等，富集的GO条目包括：姐妹染色体分离等；而下调的DEGs富集的KEGG条目包括：p53信号通路等，富集的GO条目有对营养水平的反应等。

图4 高浓度(1.5 μmol/L)治疗后DEGs热图

图5 低浓度(500 nmol/L)处理组的富集结果

图6 高浓度(1.5 μmol/L)处理组的富集结果

2.3PPI网络构建共获得高低浓度的药物处理后共同差异表达的基因257个。通过将257个DEGs输入到STRING在线数据库中，得到了蛋白质之间的相互作用网络，借助Cytoscape软件，对蛋白质相互作用网络进行可视化，并筛选出该网络中的10个关键基因，分别为ATF3、DDIT3、GADD45A、LOX、MMP1、SERPINE1、SOD2、TLR2、TXNIP和VEGFA。见图7。上述10个hub基因的具体信息见表1。

2.4关键基因的验证ATF3、DDIT3、GADD45A、LOX、MMP1、SERPINE1、SOD2、TLR2和TXNIP在PDAC组织中均明显高表达，进一步确认这些基因对PDAC的生存预后的影响， Kaplan-Meierplot数据库结果提示：DDIT3、GADD45A、LOX、MMP1、SERPINE1和TXNIP的表达对PDAC的生存预后具有显著意义。见图8。

a：高低浓度处理组DEGs交集；b:STRING构建的蛋白质相互作用网络；c:Cytoscape构建的DEGs相互作用网络；d：CytoHubba筛选的10个关键基因

表 1 10个关键基因的缩写、全称和功能

a：有统计学意义的关键基因在GEPIA2数据库中的表达情况；b：Kaplan-Meier Plotter数据库中有统计学意义的关键基因与PDAC总生存期关系的分析结果

3 讨 论

胰腺癌是人类癌症相关死亡的第四大原因，约占8%[1]。胰腺癌最初始的治疗方式是手术切除，时至今日仍然是根治胰腺癌的唯一选择。但是，仅有不到10%的胰腺癌患者能够在早期阶段被诊断出来，及时获得手术切除的机会。随着近些年新辅助治疗的的兴起，辅以更好的围手术期护理，胰腺癌患者的结局得到了稳定的改善，患者存活率的增加超过1倍，肿瘤切除和辅助治疗后5年存活率高达30%[2]。

胰腺癌细胞的标志之一是以“Warburg效应”为特征的细胞能量失调[6]。Warburg效应揭示癌细胞即使在有氧条件下也倾向于利用糖酵解来获得能量，促进癌细胞的合成代谢，有利于肿瘤的进展[7]。糖酵解作为最原始的细胞代谢过程之一，是一种低能量的供能途径。斑鸠霉素是多环四酸酯大内酰胺家族的成员，具有很强的细胞毒性活性[8-9]。斑鸠霉素在体外对PDAC具有抗增殖活性。Jiang等[10]团队证实斑鸠霉素显著影响PDAC糖酵解途径，斑鸠霉素显著诱导葡萄糖-6-磷酸水平下降，PDAC细胞内葡萄糖水平略有升高，表明斑鸠霉素对PDAC细胞糖酵通量具有抑制作用。我们的研究旨在寻找斑鸠霉素抑制糖酵解过程的其他潜在靶标。DNA损伤诱导转录本3 (DNA damage inducible transcript 3，DDIT3)，可由DNA损伤、内质网应激、缺氧和氨基酸饥饿等诱导激活[11]。DDIT3发挥转录因子的作用，通过抑制糖酵解的负调控因子TIGAR来促进糖酵解；另一方面，DDIT3转移到线粒体中通过下调COQ9和COX4的表达而减弱线粒体的呼吸。促进代谢重新编程，有助于平衡糖酵解和氧化磷酸化，允许癌细胞在代谢应激条件下生存[12]。Yamasawa等[13]确定生长停滞和DNA损伤诱导蛋白45α (growth arrest and DNA damage inducible alpha，GADD45A)是胰腺癌发生发展中的一个新因子，GADD45A蛋白的过度表达与不良预后显著相关。赖氨酰氧化酶(Lysyl Oxidase ，LOX)是一种分泌蛋白，可以参与肿瘤增殖侵袭和转移前骨病变，肝豆状核变性患者肝细胞周围胶原的异常沉积等不同的生理病理过程[14-16]。Li等[17]研究表明LOX可以增加胃癌细胞的相对葡萄糖摄取量和细胞外乳酸浓度，通过增强AKT-p70S6K-HIF1-α通路加速肿瘤细胞糖酵解速率而引起Warburg效应，促进胃癌细胞增殖。基质金属蛋白酶1(matrix metallopeptidase 1，MMP1)又称胶原酶-1，是一个多功能分子，参与多种生理过程(发育、组织形态发生和伤口愈合)。同时，MMP1也与各种疾病有关，包括癌症、类风湿性关节炎、肺气肿和纤维化疾病等[18-19]。纤溶酶原激活剂抑制剂 (serpin family E member 1，SERPINE1)，也称为PAI-1，尿激酶纤溶酶原激活剂；组织纤溶酶原激活剂，uPA及其细胞膜受体和 SERPINE1 的失调与血栓形成、心血管疾病和伤口愈合的改变有关[20-22]。硫氧还蛋白交互蛋白(thioredoxin interacting protein，TXNIP)可与硫氧还蛋白 (thioredoxin，TXN) 的表达和功能相互作用并对其进行负调节，前者通过调节β细胞功能、肝葡萄糖生成、外周葡萄糖摄取、脂肪生成和底物利用等多种作用，成为葡萄糖和脂质代谢的重要调节器[23]。

综上所述，6个关键基因中DDIT3、LOX和TXNIP与糖酵解的关系较紧密，参与癌细胞的糖酵解过程，其中DDIT3、LOX和TXNIP在PDAC中高表达，经过斑鸠霉素治疗后，其中DDIT3和LOX表达下调，而TXNIP依旧为高表达，我们预测斑鸠霉素可能还通过下调DDIT3或LOX的表达水平抑制PDAC的糖酵解过程，从而阻碍PDAC的进展。该研究通过对生物数据库的挖掘，揭示了DDIT3或LOX可能是斑鸠霉素潜在的治疗靶点，为发现斑鸠霉素抑制PDAC的潜在作用机制提供新的思路，当然假说还有待进一步的基础实验加以证实。