基孔肯雅病毒nsP1单克隆抗体制备及其在快速检测中的应用

周婷婷，杨 展，常永和，周东明，朱 进，郑 峰

0 引 言

基孔肯雅病毒(Chikungimya virus，CHIKV)为RNA病毒，属于披膜病毒科甲病毒属，可通过伊蚊传播感染人导致基孔肯雅热。患者主要症状为发热、皮疹和关节炎等，发热体温一般高于39℃，皮疹症状3～4 d后消失，但关节炎症状可能持续存在数年，少数人并发脑炎导致死亡[1-3]。基孔肯雅热过去主要分布于非洲和东南亚地区，但随着全球气温升高和经贸交流频繁，作为基孔肯雅病毒传播媒介的埃及伊蚊和白纹伊蚊活动范围扩大，该病逐渐呈现出大范围流行的趋势。我国于2008年首次报道了基孔肯雅热输入病例[4]，2010 年在东莞市发生基孔肯雅热聚集性疫情，报告病例200余人，此外在云南省、浙江省等地也曾出现疑似病例[5-6]。

CHIKV的实验室检测方法主要包括病毒分离培养、核酸检测和血清学检测，每种方法各有其优势和局限性。血清学检测方法可在病毒血症期间用于检测病毒抗原或抗体，具有灵敏度高、操作简便等优点，但在检测同一血清学组的病毒时可能出现交叉反应。现已有针对CHIKV的商品化IgM-ELISA检测试剂盒[7]，但由于人感染CHIKV通常要在5 d后产生IgM抗体[8]，因此不适用于临床早期诊断。目前，国内有关检测CHIKV抗原的免疫学方法研究尚少，如邢骁跃等[9]利用CHIKV病毒样颗粒免疫制备小鼠和兔多克隆抗体，建立了双抗体夹心ELISA检测CHIKV抗原的方法。CHIKV基因组共编码4个非结构蛋白(nsP1～nsP4)和5个结构蛋白(C、6K和3个包膜糖蛋白E1、E2和E3)，非结构蛋白的功能主要是参与病毒RNA的转录和复制，其中nsP1具有甲基酶转移活性，主要负责病毒负链RNA的合成[10]。本研究拟以nsP1蛋白为靶向分子制备检测抗体，建立双抗夹心法ELISA和胶体金免疫层析法检测CHIKV抗原，为我国的CHIKV现场快速免疫学检测方法提供技术储备。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料大肠埃希菌DH5α、BL21(DE3)、pET28a+、Sp2/0细胞为本科实验室保存。Balb/c(6～8周龄)小鼠购自上海史莱克公司。High affinityNi-NTAresion、Protein G resin为GE公司产品；弗氏完全佐剂和不完全佐剂为Sigma公司产品；胎牛血清、DMEM细胞培养基为Gibco公司产品；鼠源anti-His抗体、羊抗鼠IgG单克隆抗体购于南京金斯瑞生物技术有限公司公司；DNA Marker、质粒小提试剂盒、限制性内切酶等均购于TaKaRa生物工程有限公司；Glue活化辣根过氧化物酶(HRP)标记试剂盒购自星宝生物技术有限公司。寨卡病毒NS1蛋白为本室前期研究制备，CHIKV 感染动物血清由南部战区疾控中心惠赠。本实验引物合成和DNA产物测序均由南京金斯瑞生物技术有限公司完成。

1.2 基孔肯雅病毒nsP1重组蛋白的制备根据Genbank中公布的CHIKV基因组序列(GenBank: NC_004162.2)，人工合成nsP1蛋白编码基因，并根据大肠埃希菌的密码子偏嗜性对基因序列进行优化，克隆入原核表达载体pET28a+中，构建重组表达载体，经双酶切和DNA测序验证载体构建成功。转化菌以0.1 mmol/L终浓度IPTG分别在15 ℃下诱导16 h或在37 ℃下诱导4 h，离心后收集菌体沉淀，超声破碎后，用12%的SDS-PAGE电泳检测蛋白诱导表达情况。确定重组蛋白以包涵体形式表达后，收集超声离心后的细胞沉淀，加入8 mol/L尿素悬浮溶解包涵体，离心半径9.5 cm、12 000 r/min离心30 min，上清液用His Trap TMHP亲和吸附柱进行纯化，经过透析复性将纯化的蛋白透析到pH 7.4的0.01 mol/L PBS中，PEG-20000浓缩，SDS-PAGE和Western blot鉴定蛋白纯度。

1.3 单克隆抗体的制备与鉴定用纯化获得的nsP1重组蛋白免疫Balb/c小鼠，参照文献[11]的方法将脾细胞与SP2/0细胞融合，ELISA筛选获得杂交瘤细胞株。将杂交瘤细胞扩大培养后，按照2×106/只注入经灭菌液体石蜡(0.5mL/只)预处理的经产母鼠腹腔制备腹水。按标准操作步骤纯化腹水，离心半径10.8 cm、22 000 r/min离心30 min，收集上清并记录滤液的体积，向滤液中加入2倍体积的60 mmol/L 的醋酸钠缓冲液，pH 4.0；加入NaOH调节pH 至4.8；逐滴加入辛酸(按照每10 毫升腹水体积加入0.4 mL辛酸)，边加边搅拌，于室温下搅拌30 min；离心半径10.8 cm、22 000 r/min离心30 min，弃去沉淀，上清用NaOH 调节pH 至7.0，再次离心30 min 后，上清用1倍体积PBS 稀释后，用0.22 μm滤膜过滤后，经Protein G柱纯化。SDS-PAGE检测纯化抗体的纯度，并用2 μg/mL nsP1蛋白包被ELISA板，将抗体倍比稀释后通过ELISA检测抗体与nsP1蛋白的结合能力。

1.4 建立双抗体夹心法检测抗原按照上述单克隆抗体制备方法共获得了6株抗nsP1单克隆抗体。根据试剂盒说明书对纯化的6株单抗进行辣根过氧化物酶(HRP)标记，棋盘法进行双抗体夹心检测抗原，筛选出配对的捕获抗体和检测抗体，具体方法如下：分别以6种抗体100 ng/孔包被酶联板，每孔加入20ng nsP1抗原起始，梯度稀释加入酶联板中，37 ℃孵育1 h，PBST洗涤5遍，将HRP标记的抗nsP1抗体按照1∶500起始梯度稀释加入每孔，37 ℃孵育1 h，PBST洗涤5遍，加入显色液显色，测定A450处的吸光度值。同时，以寨卡病毒NS1蛋白作为阴性对照平行检测，以评价该方法的特异性。

1.5 建立免疫层析方法检测CHIKV抗原将所筛选得到的捕获抗体喷涂于硝酸纤维素膜上作为检测带，将商品化的羊抗鼠IgG喷涂于硝酸纤维素膜上作为质控带。将检测抗体标记胶体金，制备相应的免疫层析试剂。用不同浓度的nsP1抗原或CHIKV感染动物血清进行免疫层析检测，以PBS溶液作为空白对照，对检测结果进行评估。

2 结 果

2.1 基孔肯雅病毒重组nsP1蛋白的表达和纯化将构建成功的质粒分别转化大肠埃希菌BL21(DE3)中，经过IPTG在不同温度下诱导发现，重组蛋白主要以包涵体的形式表达，见图1。因此我们选择在15 ℃条件下大量培养诱导16 h，超声裂解收集包涵体，使用8 mol/L尿素变性，经镍柱亲和层析纯化后，透析复性得到纯化的重组蛋白nsP1相对分子质量约为45 000，浓度约为0.8 mg/mL，见图2a。用anti-His抗体进行Western blot检测，证明该蛋白确为表达的重组蛋白，见图2b。

2.2 抗nsP1特异性抗体的纯化和鉴定使用重组nsP1蛋白免疫小鼠，按照常规方法制备杂交瘤细胞株，筛选得到6株高表达抗nsP1单克隆抗体的阳性克隆株，编号分别为nsP1-102、nsP1-1C312、nsP1-2A302、nsP1-1A201、nsP1-1D601、nsP1-1B101。制备小鼠腹水，经Protein G亲和层析柱纯化，SDS-PAGE检测显示纯化得到的抗体纯度均达到95%以上，见图3a。非竞争ELISA检测结果显示，抗体经过梯度稀释之后，ELISA反应得到的A450值呈规律性变化，与抗体浓度的改变趋势相同，证明纯化的抗nsP1单抗与重组蛋白有很好的结合能力，见图3b。

M: Protein marker; 1: 未诱导的全细胞; 2: 15 ℃诱导16 h的全细胞; 3: 37 ℃诱导4 h的全细胞;4:未诱导的细胞裂解上清; 5: 15 ℃诱导16 h的细胞裂解上清; 6:37 ℃诱导4 h的细胞裂解上清; 7:未诱导的细胞裂解沉淀; 8: 15 ℃诱导16 h的细胞裂解沉淀; 9: 37 ℃诱导4 h的细胞裂解沉淀图1 nsP1蛋白诱导表达条件分析Figure 1 Analysis of prokaryotic induced expression conditions of nsP1 protein

M:蛋白marker; 1:BSA(2 μg); 2、3:纯化的nsP1蛋白a：SDS-PAGE检测; b：Western blot检测图2 基孔肯雅病毒nsP1重组蛋白的纯化与检测Figure 2 Purification and detection of nsP1 recombinant protein

M: 蛋白marker; 1: 纯化的抗nsP1单抗a：SDS-PAGE检测；b：ELISA检测抗体效价图3 抗nsP1单克隆抗体的鉴定Figure 3 Identification of monoclonal antibody against nsp1

2.3 双抗体夹心法检测nsP1抗原单抗nsP1-1A201和HRP标记的单抗nsP1-102能够通过双抗体夹心法检测出基孔肯雅nsP1抗原，最低检出值约为1.25 ng，而以同样浓度的寨卡病毒NS1蛋白作为对照，则检测结果均为阴性，见图4。表明该方法具备较好的特异性。

图4 双抗体夹心法检测nsP1抗原

2.4 双抗夹心免疫层析试剂的检测本研究制备的胶体金试纸条可检测出1ng的nsP1抗原，而PBS溶液检测为阴性。此外，我们还用该方法对2份CHIKV感染动物血清进行了检测，结果均为阳性。上述实验表明我们成功建立了能快速检测CHIKV的胶体金免疫层析方法。

3 讨 论

由于人感染基孔肯雅病毒后多为隐性，而且其传播媒介和临床表现都与登革热等虫媒病相似，少数患者出现的发热、出疹、结膜炎和关节痛等临床症状均不具有特异性，导致患者在感染早期发生误诊漏诊的情况，从而影响了临床治疗和疫情控制[12]。因此，CHIKV感染的确诊需要结合实验室检测结果(如核酸诊断、免疫学诊断)。虽然荧光定量PCR检测具有高特异性和高敏感性的优点，但高度依赖专业实验室和专业人员，不适于在基层医疗卫生机构和野外条件下开展，所以研发基于抗原/抗体特异性识别的CHIKV免疫学快速检测方法，对于该病的早期防控具有重要意义。

与结构蛋白相比，基孔肯雅病毒的nsP1氨基酸序列较为保守[13]，与其他易产生误诊的病毒如登革、黄热病毒等同源性低，同时可刺激宿主产生T细胞免疫以及体液免疫应答[14-16]，是一种较为理想的免疫学诊断靶向分子。此外，由于nsP1在基孔肯雅病毒的RNA复制过程中至关重要，因而也被视为治疗CHIKV感染的潜在靶点[13,17]。本研究选取基孔肯雅病毒的非结构蛋白nsP1作为检测靶点，构建载体原核表达纯化得到了重组nsP1蛋白，制备了6株抗nsP1单克隆抗体，并筛选配对抗体建立了针对CHIKV抗原的双抗夹心ELISA和免疫层析检测方法，为开发适用于基层医疗卫生机构和出入境检疫部门的简便、廉价的CHIKV检测试剂奠定了基础。下一步我们将对免疫层析相关的所有固相材料和液相反应体系进行系统筛选和优化，以获得最优的敏感性与特异性。