肉豆蔻提取物改善缺血缺氧大鼠脑损伤的作用机制

邱新茹，宗堪堪，孙 周，崔春爱

0 引 言

血管性痴呆(vascular dementia, VD)是继阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease, AD)第2种痴呆常见类型，属进行性认知功能减退的神经退行性疾病，且因男性较于女性更容易患脑血管疾病，故男性发病率高于女性[1]，可诱发一系列极具破坏性的脑内损伤，最终导致心脑血管疾病综合征[2]，故及早防治至关重要。

克老素基因作为一种“抗衰老基因”，主要在肾和脑脉络膜表达，可能对老年高血压、冠心病及认知功能障碍等衰老相关性疾病的发生与发展有调节作用。研究表明，外周给予的α-KL蛋白片段，可通过诱导NMDAR亚基GluN2B的分裂，增强NMDAR依赖性突触可塑性及其记忆力，证明对人类有治疗作用[3]。研究报道，作为药、食两用的高大乔木植物Myristica fragrans种仁中的肉豆蔻提取物可通过抑制小胶质细胞诱导的神经炎症及慢性缺血缺氧诱导的血管内皮细胞凋亡[4-5]，改善大脑微环境的稳定及大鼠空间学习和记忆能力[6]，但其在VD等血管性认知障碍相关疾病中的作用机制尚不清楚。本研究探讨肉豆蔻提取物对慢性缺血缺氧诱导的抗衰老因子克老素表达及PI3K/Akt相关蛋白表达的调控作用，为其防治提供新的依据。

1 材料与方法

1.1 动物40只健康雄性Wistar大鼠(230±20)g，由延边大学实验动物中心提供，实验动物许可证号为[SCXK(吉)2017-0003]，经医学院医学伦理委员会批准(批准号：20160302)，饲养环境：自然光线，24 h明暗交替，室温24～26 ℃，完全随机法分为对照组、慢性脑低灌注模型组和肉豆蔻提取物低剂量组、中剂量组和高剂量组。

1.2主要药物及试剂肉豆蔻提取物(Aladdin, 22888-70-6)；大鼠Klotho酶联免疫吸附检测试剂盒(CUSABIO,CSB-E14958r)；兔单克隆抗体Klotho[EPR6856](abcam, ab1813)、兔多克隆抗体PI3K p85(CST, #4292)和磷酸化的PI3K(abcam, ab1826)、兔单克隆抗体AKT(CST， #4691)和磷酸化的AKT(CST, #4060)、p-mTOR(CST, #5536)、兔单克隆抗体FoxO3a(D19A7)和磷酸化的FoxO3a(CST, #12829)、兔单克隆抗体β-actin(CST, #4970)和GAPDH(CST, #5174)。

1.3BCCAo动物模型制备及分组40只健康雄性Wistar大鼠(230±20)g，由延边大学实验动物中心提供，实验动物许可证号为[SCXK(吉)2017-0003]。经过1周的适应性饲养后，采用永久性结扎双侧颈总动脉(bilateral common carotid artery occlusion，BCCAo)方法，制备慢性脑低灌注(chronic cerebral hypoperfusion, CCH)大鼠模型[7]，完全随机法分为对照组(假手术组)、模型组和肉豆蔻低、中、高剂量组(2.5、5、10 mg/kg)，每组8只。术后20 d起，对照组与模型组给予同等剂量的等渗盐水灌胃，各实验组给予不同浓度的肉豆蔻提取物灌胃，至术后60 d为止。

1.4神经行为学检测运用Morris水迷宫，检测各组大鼠逃避潜伏期，以此来比较其空间学习和记忆能力。模型制备第45天，历时8 d的水中找录平台的学习和训练、每只大鼠每天连续入水3次(每次间隔为90 s)，每次入水训练时间的限度为90 s，记录其在90 s内找寻水下2 cm处安全平台的时间，即逃避潜伏期。8 d的游泳训练中，第2、4、6和8天的第1次训练为probe测试。因此，本实验主要分析了第1、3、5、7天的3次逃避潜伏期，观察其空间学习和记忆能力，期间各组大鼠继续每天给予药物或等渗盐水灌胃，直到处死。

1.5HE染色法术后第61天，按照常规心脏灌流方法，运用预冷的PBS和4%甲醛溶液进行心脏灌流及其前固定，经过取脑、多聚甲醛后固定和梯度蔗糖脱水、石蜡包埋和切片、HE染色，显微镜下观察对照组、模型组和高剂量肉豆蔻木酚素(10 mg/kg)干预组大鼠海马区神经元的形态学变化，并在高倍显微镜下随机计数10个海马各区存活的神经元数量，进行统计学分析。

1.6酶联免疫吸附法术后第61天，3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，经过断头、取脑，分离出海马组织，按照ELISA试剂盒，采用生物素双抗夹心酶联免疫吸附法，检测大鼠海马组织中克老素水平。所有样品，均进行重复分析，样品检测值均与标准蛋白质的含量标准化。

1.7Western blot方法术后第61天，大鼠取脑，分离海马组织，制备各组海马组织匀浆液，按照本实验室已成形的免疫印迹方法[6]，提取总蛋白，经过蛋白定量、蛋白变性、常规电泳、转膜、封闭等常规操作。其次，在克老素、p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT、p-FoxO3a、β-actin和GAPDH等一抗溶液(1：1000)中孵育振荡过夜(4 ℃)。

2 结 果

2.1 肉豆蔻提取物改善缺血后大鼠空间认知功能损害各组实验动物在游泳速度上差异无统计学意义(P>0.05)，第3天、第5天、第7天结果显示，模型组大鼠较对照组逃避潜伏期明显延长(P<0.01)；而肉豆蔻干预组大鼠与对照组差异无统计学意义(P>0.05)；肉豆蔻干预组与模型组大鼠间差异有统计学意义(P<0.01)。见图1。

a：游泳速度比较； b：逃避潜伏期

2.2肉豆蔻提取物抑制缺血后大鼠海马神经元损害HE染色结果显示，低灌注模型组大鼠海马CA1、CA2区锥体细胞及DG区颗粒细胞神经元排列紊乱，神经元形态各异、胞体萎缩、核深染，见图2a，存活的神经元数量减少，模型组大鼠海马各区神经元存活率较对照组明显减少(P<0.01)；肉豆蔻干预组与模型组大鼠间差异有统计学意义(P<0.01)，见图2b；而经肉豆蔻提取物干预组神经元形态变化和结构得到明显缓解，神经元形态基本与对照组海马区组织结构相似，见图3。

a：神经元形态(HE ×40); b：海马各区存活的神经数量比较

图3 肉豆蔻提取物抑制大鼠海马神经元变性和坏死(HE ×400)

2.3 肉豆蔻提取物增强海马组织抗衰老因子Klotho水平ELISA和免疫印迹法检测结果显示，模型组大鼠海马组织中Klotho水平明显低于对照组(P<0.01)；肉豆蔻提取物处理组Klotho水平明显高于模型组(P<0.05)，见图4。

1：对照组；2：模型组；3：肉豆蔻低剂量组；4：肉豆蔻中剂量组；5：肉豆蔻高剂量组

2.4大鼠海马组织PI3K/Akt/FoxO3a的表达Western blot实验结果显示，与对照组相比较，PI3K、AKT和FoxO3a的磷酸化水平明显升高(P<0.01)；肉豆蔻提取物可以逆转相关蛋白磷酸化水平，使其表达降低(P<0.05)，明显抑制了PI3K/Akt/FoxO3a的活化。见图5，表1。

1：对照组；2：模型组；3：肉豆蔻低剂量组；4：肉豆蔻中剂量组；5：肉豆蔻高剂量组

表 1 肉豆蔻提取物对缺血缺氧诱导的蛋白表达量的影响

3 讨 论

传统中医药理论也认为，通过“未病先防”和“既病防变”的过程，调理与衰老相伴的脑血管病和神经退行性疾病。随着“老龄化社会”的到来，脑血管病及神经退行性疾病的发病势头强劲，趋于年轻化，危害着人们的生命健康及生活质量，给社会和医疗环境带来了沉重的负担和痛苦。因此，有必要针对认知脆弱的老年人以及患有脑血管病的患者施以预防措施，提高“大脑的恢复力”，可能是改善认知功能障碍的一种新的治疗策略。衰老细胞在脑内不断累积促进了脑内慢性炎症，耗尽神经系统再生能力使神经元功能丧失，引起脑灌注不足和破坏血脑屏障完整性，推动了脑功能恶化，海马作为学习记忆相关的重要区域，易受缺血、缺氧的影响，大脑表现出相关的病理变化，导致神经退行性疾病[9-10]。

我国药典中记载肉豆蔻产于我国两广南部、云南、台湾等区域，具有温中涩肠、行气消食，而主治虚泻冷痢、脘腹冷痛、食少呕吐及宿食不消，还当作可食用的佐料，是重要的香料和药用植物，可通过抑制小胶质细胞的激活及神经凋亡，改善大鼠空间学习和认知功能[5-6,11]。小胶质细胞作为脑内的免疫细胞，具有一定的吞噬清除能力，其包括M1和M2两种活化形式，但这两者作用相反，M1型过度激活会促进脑内炎症和损伤，在神经退行性疾病进程中起着关键性作用，M2型则起到神经保护作用[12]。研究发现，CCH会引起很多促炎因子(INF-α、IL-1β、IL-6等)的产生，促进了小胶质细胞的激活和ROS累积，从而导致神经元损伤和神经功能障碍[13-15]。

Klotho基因是一种抗衰老基因，其过度表达可延长寿命，增强海马依赖性学习和记忆功能，是调节体内多种受体亲和力的辅助因子，可防止与衰老相关的认知功能下降[8]，主要在肾、脑脉络丛和神经元中高表达，参与到多种代谢途径中[16]，大脑也可产生分泌型克老素蛋白，发挥着抗衰老等神经保护作用[17]。研究发现，通过慢病毒介导脑内Klotho过表达，可以抑制Akt/mTOR通路，使自噬-溶酶体系统激活，从而提高对β-淀粉样蛋白的清除能力，最终改善神经血管单元损害和脑内毛细血管功能障碍[18-19]。此外，克老素可以刺激负责巩固记忆的GluN2B亚基N-甲基-D-天冬氨酸受体升高，增强LTP以改善认知记忆功能，并且抑制胰岛素样生长因子生成和Wnt通路激活起到延缓衰老的作用[20-21]。虽然，外源性的Klotho为大分子蛋白(相对分子质量约130 000)不易通过血脑屏障进入脑内发挥其生物学作用，而外源性注入的ɑ-KL蛋白片段可通过诱导NMDAR亚基GluN2B的分裂，增强NMDAR依赖性突触可塑性及其记忆力[3]，故对体内内源性克老素蛋白含量的调控意义尤其重要。在本实验中，肉豆蔻提取物明显增强了慢性缺血缺氧所诱导的大鼠海马组织中克老素水平和蛋白表达，与大鼠空间学习和记忆功能的调控结果相一致[22]。

炎症反应是机体对抗感染和损伤做出的自我保护措施，修复组织损伤，防止病原体扩散，PI3K/AKT是促炎介质表达的关键性调控通路。AD模型大鼠的皮层、海马、隔核等区域有FoxO3a 免疫阳性物质分布，FoxO3a是PI3K/Akt信号通路下游的重要转录因子，Akt途径被抑制时，去磷酸化的FoxO3a大部分进入细胞核，调节不同的凋亡靶目标，导致细胞凋亡[23]。因此，调控PI3K/Akt/FoxO3a通路中的关键蛋白，寻找神经炎症的治疗靶点，明确其发病机制，开发有效药物成为亟待解决的问题。当Akt/mTOR信号通路异常活化时FoxO3a的磷酸化水平升高；而其升高可抑制细胞凋亡，从而可假设通过抑制PI3K/Akt/FoxO3a信号网络中的关键点，调控小胶质细胞的增殖和激活，就可控制神经炎症病变的发生和发展，FoxO3a的激活是维持神经元存活所必需的。体外研究也表明，可能通过调节FoxO3a基因转录过程，保护小脑颗粒神经元免受氧化应激损伤和调控细胞凋亡[4,24]。本实验结果也显示，肉豆蔻提取物显著抑制了慢性缺血缺氧诱导的大鼠海马组织PI3K、Akt、FoxO3a的磷酸化水平，增强了Klotho蛋白的表达，发挥了明显的抗衰老、抗炎效力，延缓了大鼠海马神经元细胞的衰老进程，对CCH海马区神经元衰老与损伤发挥保护作用。

综上所述，通过CCH模型大鼠脑组织研究得出肉豆蔻提取物通过抑制PI3K/AKT/FoxO3a信号通路，减少其磷酸化水平，并可增强克老素蛋白的表达和脑组织内含量，从而发挥抑制神经元损伤，改善大鼠学习和记忆功能，可能具有预防衰老和神经炎症的治疗潜力。