LINC00511通过靶向对滋养层细胞迁移侵袭和上皮间质转化的影响

张 芹，卫 兵，王文艳

0 引 言

子痫前期(preeclampsia，PE) 是妊娠20周后出现高血压和蛋白尿的一种妊娠并发症，是围产期孕产妇发病和死亡的主要原因，约占全球发病率的4%-5%[1-2]。怀孕使女性更易患肺水肿、肝肾衰竭、癫痫、脑出血甚至死亡，PE则严重危害的母婴健康。研究表明，绒毛外滋养细胞在胎盘发育中发挥着重要作用，滋养层细胞的迁移、侵袭和上皮间质转化(epithelial mesenchymal transformation，EMT)能力差被认为是PE发生的主要原因[3]。目前，导致PE广泛的危险因素包括遗传、环境和社会因素等，但其确切的发病机制尚不完全清楚。因此，亟待探究PE的病理机制，以期为临床治疗提供更有效的方法。长非编码RNA(lncRNAs)是指长度超过200个核苷酸且不具有编码蛋白功能的转录本，与人类多种疾病的发生发展密切相关。研究报道，LINC00511位于17q24.3染色体上，与人类多种癌症和PE进展密切相关。LINC00511在PE患者胎盘组织中表达下调，过表达LINC00511可促进滋养层细胞的增殖、迁移和侵袭[4]。敲除LINC00511后，细胞的侵袭、迁移、增殖以及自噬过程均受到抑制，同时促使细胞大量凋亡[5]。研究表明，miR-16-5p可逆转过表达LINC00473对HTR8/SVneo和JEG-3细胞侵袭的促进作用[6]。在PE大鼠模型中，川芎嗪通过调控miR-16-5p/IGF-2轴抑制滋养层细胞自噬，促进细胞存活和迁移[7]。然而LINC00511对滋养层细胞的影响及其机制是否与miR-16-5p有关尚未完全明确。因此，本实验旨在研究LINC00511是否通过靶向调控miR-16-5p表达来影响HTR-8/Svneo细胞的迁移侵袭和EMT。

1 材料与方法

1.1 组织来源选取2016年1月至2019年1月安徽医科大学第二附属医院妇产科60例剖宫产产妇的的胎盘组织。胎盘组织收集自坏死区以外的胎盘裂片中，保存在-80 ℃液氮中。其中30例产妇符合PE诊断标准[8]，每位受试者均无其它妊娠并发症。本研究经安徽医科大学第二附属医院伦理委员会批准(PJ-YX2018-031)，患者均签署知情同意书。

1.2材料人绒毛膜滋养层细胞系HTR-8/Svneo购自美国的ATCC细胞库；胰蛋白酶、胎牛血清、青霉素-链霉素购自美国Gibco公司；DMEM/F12培养基购自美国Sigma公司；Trizol、反转录、qRT-PCR试剂盒购自日本Takara公司；Matrigel胶、Transwell小室购买于美国BD公司；RIPA蛋白裂解液、二辛可宁酸(BCA)试剂盒购自上海研谨生物科技有限公司；从北京百奥莱博科技有限公司购买双荧光素酶报告基因检测试剂盒；从上海索宝生物科技有限公司购买pcDNA-NC、pcDNA-LINC00511；anti-miR-NC、anti-miR-16-5p、miR-NC、miR-16-5p、si-NC、si-LINC00511购自上海吉玛制药技术有限公司；Lipofectamine2000购自美国Invitrogen公司。

1.3细胞转染与分组在DMEM/F12培养基中培养HTR-8/Svneo细胞，培养基中含有链霉素、10% 胎牛血清、青霉素，在恒温37 ℃以及5% CO2条件下培养，直至细胞90% 融合度时，进行传代。将pcDNA-NC、pcDNA-LINC00511、anti-miR-NC、anti-miR-16-5p、si-NC、si-LINC00511分别转染至HTR-8/Svneo细胞中，记为pcDNA-NC组、pcDNA-LINC00511组、anti-miR-NC组、anti-miR-16-5p组、si-NC组、si-LINC00511组；pcDNA-LINC00511分别与miR-NC、miR-16-5p共转染至HTR-8/Svneo细胞中，记为pcDNA-LINC00511+miR-NC组、pcDNA-LINC00511+miR-16-5p组。

1.4RT-qPCR提取细胞总RNA，反转录成cDNA，LINC00511、miR-16-5p分别以GAPDH和U6为内参，以2-△△Ct法计算其相对表达量。LINC00511上游引物序列：5′-CTAACAAGAGGGTAAGTGTCAG-3′，下游引物序列：5′-AAGTCGACAACCCCATCGTTAC-3′；GAPDH上游引物序列：5′-CATCAAGAAGGTGGTGAAGCAG-3′，下游引物序列：5′-CGTCAAAGGTGGAGGAGTGG-3′；miR-16-5p上游引物序列：5′-TCCACTCTAGCAGCACGTAAAT-3′，下游引物序列：5′-TCACACTAAAGCAGCACAGTAAT-3′；U6上游引物序列：5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3′，下游引物序列：5′-GGAACGCTTCACGAATTTG-3′；由上海生工生物工程公司负责实验引物的合成工作。

1.5Transwell检测细胞的迁移与侵袭HTR-8/Svneo细胞接种至Transwell小室中，小室中铺有基质凝胶，2×104个/孔，培养基为DMEM/F12，其中含10%胎牛血清，在37 ℃恒温条件下持续孵育，24 h后使用棉签擦去滤膜上层胶以及细胞，多聚甲醛固定，染色溶液为0.1%结晶紫染液，染色后置于显微镜下观察，对各组细胞的侵袭、迁移情况进行记录。

1.6Western blot法测定蛋白的表达水平对各组细胞的总蛋白进行提取、定量分析，试剂盒为BCA试剂盒。按照60 μg/孔实施SDS-PAGE电泳并转至PVDF膜，5%脱脂牛奶室温封闭，一抗4 ℃孵育过夜，二抗在室温条件下持续孵育，1 h后进行显影以及定影处理，以GAPDH为内参分析蛋白条带灰度值，软件为ImageJ。

1.7双荧光素酶报告实验构建LINC00511野生型和突变型荧光素酶表达载体WT-LINC00511和MUT-LINC00511，将其分别与miR-NC和miR-16-5p共转染至HTR-8/Svneo细胞，严格按照说明书的步骤进行荧光素酶活性检测工作。

2 结 果

2.1 PE组织中的LINC00511、miR-16-5p表达水平差异PE胎盘组织LINC00511表达水平(0.45±0.03)较正常胎盘组织(1.01±0.05)显著降低(P<0.05)，miR-16-5p的表达水平(2.93±0.15)较正常胎盘组织(0.99±0.07)显著升高(P<0.05)。

2.2HTR-8/Svneo细胞LINC00511表达上调对迁移、侵袭和EMT水平的影响pcDNA-LINC00511组LINC00511表达水平较pcDNA组明显升高，迁移细胞数、侵袭细胞数、MMP-2、MMP-9、Vimentin、N-cadherin和Twist1的表达水平显著升高，E-cadherin的表达水平显著降低(P<0.05)，见图1、图2，表1。

图1 上调LINC00511表达对HTR-8/Svneo细胞的迁移侵袭的影响

1: pcDNA组;2: pcDNA-LINC00511组

表1 上调LINC00511表达对HTR-8/Svneo细胞迁移侵袭及EMT的影响

2.3LINC00511对miR-16-5p表达水平的靶向调控作用StarBase预测显示，miR-16-5p与LINC00511部分序列互补，见图3。相比于WT-LINC00511转染miR-NC后的双荧光素酶报告结果，转染miR-16-5p的荧光素酶活性(0.41±0.02)较miR-NC(1.01±0.04)显著降低(P<0.05)，而在MUT-LINC00511中，转染miR-NC(0.99±0.04)和miR-16-5p的荧光素酶活性(1.02±0.06)无显著差异(P>0.05)。pcDNA-LINC00511组miR-16-5p表达水平较pcDNA组明显降低(P<0.05)；si-LINC00511组miR-16-5p表达水平较si-NC组明显升高(P<0.05)，见表2。

图3 miR-16-5p与LINC00511部分序列互补

表2 LINC00511调控miR-16-5p表达

2.4HTR-8/Svneo细胞miR-16-5p表达下调对迁移、侵袭、EMT的影响与anti-miR-NC组比较，anti-miR-16-5p组miR-16-5p的表达水平显著降低，迁移细胞数、侵袭细胞数、MMP-2、MMP-9、Vimentin、N-cadherin和Twist1的表达水平显著升高，E-cadherin的表达水平显著降低(P<0.05)，见图4、图5，表3。

图4 抑制miR-16-5p表达对HTR-8/Svneo细胞的迁移侵袭的影响

1：anti-miR-NC组； 2：anti-miR-16-5p组

表3 抑制miR-16-5p表达对HTR-8/Svneo细胞迁移侵袭及EMT的影响

图 7 过表达miR-16-5p逆转了上调LINC00511表达对HTR-8/Svneo细胞的迁移侵袭的影响Figure 7 Overexpression of miR-16-5preversed the effect of up-regulated LINC00511 expression on migration, invasion and EMT of HTR-8/Svneo cells

2.5过表达miR-16-5p逆转了上调LINC00511表达对HTR-8/Svneo细胞迁移侵袭和EMT的影响与pcDNA-LINC00511+miR-NC组比较，pcDNA-LINC00511+miR-16-5p组miR-16-5p的表达水平显著升高，迁移细胞数、侵袭细胞数、MMP-2、MMP-9、Vimentin、N-cadherin和Twist1的表达水平显著降低，E-cadherin的表达水平显著升高(P<0.05)，见图6、图7，表4。

1: pcDNA组;2: pcDNA-LINC00511组;3: pcDNA-LINC00511+miR-NC组;4: pcDNA-LINC00511+miR-16-5p组

表4 过表达miR-16-5p逆转了上调LINC00511表达对HTR-8/Svneo细胞迁移侵袭及EMT的影响

3 讨 论

PE是一种多系统的妊娠综合征，与孕产妇和婴儿高发病率和死亡率有关。在正常妊娠的母体螺旋动脉重构过程中，动脉转化为大直径、低阻力的血管，为绒毛滋养层细胞提供稳定的母体血液灌注[9-10]。滋养层细胞侵袭失败可能导致螺旋动脉重构不足，在PE发病机制中起重要作用。研究报道，lncRNAs参与人类多种疾病的发病机制，包括肿瘤、心肌梗死、糖尿病肾病和神经退行性疾病等。越来越多研究表明，lncRNAs在PE发生发展中的作用，如lncRNA AGAP2-AS1在重度PE胎盘组织中异常下调，lncRNA AGAP2-AS1的下调抑制滋养层的增殖和侵袭，促进细胞凋亡，参与了PE的发展[11]。lncRNA AK002210可促进滋养层细胞的增殖和迁移侵袭，敲减lncRNA AK002210通过miR-590-3p/NAIP和ERK/MMP信号通路在PE进展中发挥关键作用[12]。lncRNA MALAT1通过FOS诱导的EMT促进滋养层细胞的迁移和侵袭[13]。lncRNA SNHG12促进滋养层细胞的增殖、迁移和侵袭，与MMP-2、MMP-9、β-catenin、Vimentin的表达呈正相关，与E-cadherin的表达呈负相关[14]。lncRNA SNHG14在PE胎盘组织中低表达，上调lncRNA SNHG14促进HTR-8/SVneo细胞的迁移、侵袭和EMT[15]。过表达lncRNA HOXA-AS2可增强HTR-8/SVneo细胞的侵袭、迁移以及EMT过程[16]。LINC00511在口腔癌、乳腺癌、骨肉瘤、宫颈癌、结直肠癌等中发挥肿瘤致癌基因作用，本实验结果显示，LINC00511在PE胎盘组织中低表达，上调LINC00511表达促进HTR-8/Svneo细胞的迁移侵袭和EMT，显著升高MMP-2、MMP-9、Vimentin、N-cadherin和Twist1的表达水平，降低E-cadherin的表达水平。提示上调LINC00511表达可促进HTR-8/Svneo细胞的迁移侵袭和EMT。

研究表明，lncRNAs可作为内源竞争性RNA负调控miRNA表达调节滋养层细胞增殖、迁移侵袭和凋亡。StarBase预测显示miR-16-5p与LINC00511部分序列互补，在WT-LINC00511中，miR-16-5p组的双荧光素酶活性显著降低，且过表达和抑制LINC00511分别显著降低和提高miR-16-5p的表达水平，即LINC00511靶向负调控miR-16-5p的表达。研究发现，miR的异常表达与PE进展有关。如miR-200b可通过靶向调控SOX2蛋白表达影响HTR-8/Svneo细胞的侵袭和迁移能力[17]。miR-574的上调抑制了HTR-8/Svneo细胞的增殖和侵袭[18]。miR-182-5p在PE胎盘组织和HTR-8/SVneo细胞中高表达，hsa_circ_0007121通过miR-182-5p/PGF轴促进HTR-8/SVneo细胞的增殖、迁移、侵袭和EMT[19]。在从PE组织分离的和缺氧诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)中，miR-141-3p表达上调，下调miR-141-3p表达可促进HUVECs的存活、小管形成和迁移侵袭，抑制细胞凋亡，消除缺氧对HUVECs的影响[20]。黄芩苷通过下调miR-155-5p表达，可以使滋养层细胞快速增殖，同时对细胞的迁移、侵袭过程起到促进作用。与上述研究数据相符，本实验数据说明PE胎盘组织中的miR-16-5p呈现高水平表达，抑制miR-16-5p表达促进HTR-8/Svneo细胞的迁移侵袭和EMT，显著升高MMP-2、MMP-9、Vimentin、N-cadherin和Twist1的表达水平，降低E-cadherin的表达水平。提示抑制miR-16-5p表达可促进HTR-8/Svneo细胞的迁移侵袭和EMT。且过表达miR-16-5p逆转了上调LINC00511表达对HTR-8/Svneo细胞迁移侵袭和EMT的影响，HTR-8/Svneo细胞的迁移侵袭和EMT能力下降，MMP-2、MMP-9、Vimentin、N-cadherin和Twist1的表达水平降低，E-cadherin的表达水平升高。提示LINC00511可能通过调控miR-16-5p表达影响HTR-8/Svneo细胞的迁移侵袭和EMT。

综上所述，LINC00511在PE胎盘组织中低表达，上调LINC00511表达可能通过靶向下调miR-16-5p表达促进HTR-8/Svneo细胞的迁移侵袭和EMT。