关于氨基酸分离的创新层析实验的探究

朱彩瑜 赵雨彤 刘先俊 朱勇 汪长东

摘要：通过对创新层析实验的结果分析，对实验中出现的异常现象的讨论，给出了对该创新层析实验合理性的评价以及提高实验可行性的相关建议，可为其他物质的分离提供参考。

关键词：氨基酸；层析；异常现象

中图分类号：Q52 文献标志码：A 文章编号：1674-9324（2019）01-0274-05

一、引言

物质的分离常用到色谱分析的方法，而以往色谱分析的固定相往往是固定不动的，只有流动相才会运动，如薄层色谱以硅胶、氧化铝等为固定相，离子交换色谱以离子交换填料为固定相[1-4]。本实验利用水相与流动相流动速度的差异作为结果判断依据，采取以流动物质水为固定相的纸层析法来分离氨基酸。由于滤纸中纤维素分子含大量羟基，因而纤维素也具有硅胶的部分性质，其亲水性强，能吸收约22%的水分[5]形成流动固定相。

运用纸层析法分离物质，试样无需经过预处理，方法简便，仪器廉价，可用于染料、农药、医药、中草药等的有效成分的分离分析[5，6]，对日常生产生活具有深刻的意义。

二、实验过程

（一）实验原理

转氨基是氨基酸代谢过程中的一个重要反应。每种转氨基反应均由专一的转氨酶催化，转氨酶广泛分布于机体各组织、器官。在转氨酶的催化下，氨基酸的α氨基与α酮酸的α酮基的互换反应称为转氨基作用。

本实验用纸层析法观察-酮戊二酸与丙氨酸在肝脏谷丙转氨酶（ALT）催化下的转氨基作用。

实验分为测定组与对照组。测定组发生转氨基反应，在最后的体系中存在有两种氨基酸；而对照组不发生转氨基反应，最后体系中只有反應物中一种氨基酸。用煮沸方法使得谷丙转氨酶（ALT）失活而终止反应，然后用纸层析法对两种氨基酸进行分离鉴定。

纸层析法按操作方法分成两类即垂直型和水平型。垂直型是将滤纸条悬挂，使流动相向上或向下扩散。水平型是将圆形滤纸置于水平位，溶剂由中心向四周扩散。纸层析法的分离原理是分配层析，分配层析是利用混合物在两种或两种以上的不同溶剂中分配系数的不同而使物质分离的方法，相当于一种连续的萃取过程。本实验采取水平型纸层析法，以滤纸为支撑介质，水被吸附在滤纸的纤维之间形成固定相。某些与水不相溶的有机溶剂如醇、酚等为常用的流动相。把预分离的物质加在纸的一端，使流动溶剂经此向另一端移动，这样物质随着流动相的移动进行连续、动态的不断分配。由于物质分配系数的差异[7]，移动速度就不一样，在固定相中分配趋势较大的组分，随流动相移动的速度就慢；反之，在流动相分配趋势较大的成分，移动速度就快，而水项流动速度最慢，最终不同的组分彼此分离，水相与流动相流动速度的差异可作为结果判断依据。物质在纸上移动的速率可以用比移值（Rf）表示[8，9]：物质在一定的溶剂中的分配系数是一定的，故比移值（Rf）也相对恒定，因此在同一层析体系中可用Rf值来鉴别被分离的物质[10]。用纸层析法分离氨基酸混合物时，影响Rf值的主要因素是侧链基团的极性。例如丙氨酸侧链极性要小于谷氨酸侧链的极性，所以混合物中丙氨酸在滤纸上运动要快，Rf值大；反之谷氨酸在滤纸上运动慢，Rf值小。

（二）实验材料与仪器

1.仪器：剪刀；镊子；托盘；培养皿；表面皿；毛细管；吹风机；水浴箱；烘箱。

2.试剂：（1）pH7.4 0.01mol/L磷酸缓冲液；

（2）0.2mol/L丙氨酸溶液；（3）0.1mol/L α-酮戊二酸溶液；（4）0.1mol/L谷氨酸溶液；（5）0.5%茚三酮溶液；

（6）层析溶液：乙醇和蒸馏水的混合液（（体积比）乙醇：蒸馏水=3∶1）。

（三）实验步骤

1.肝匀浆制备：取新鲜的动物肝脏0.5g，在研钵中剪碎，研成匀浆，加入9倍体积（4.5ml）pH7.4 0.01mol/L磷酸缓冲液。

2.转氨基反应：取干燥小试管（或离心管）二支，分别标明测定管与对照管，各加入肝匀浆10滴，测定管加入37℃水浴保温10min，对照管放入沸水浴中煮10min，待对照管冷却后，于两试管中分别加入0.1mol/L丙氨酸10滴，0.1mol/L α-酮戊二酸10滴，pH7.4 0.01mol/L磷酸缓冲液1.5ml，摇匀，放进37℃水浴保温30min，保温完毕，立即将测定管放入沸水浴中煮沸10min以终止反应，取出冷却后，过滤。取滤液备用。

3.层析：取直径9cm圆形滤纸一张，用圆规作半径1cm同心圆，通过圆心作两条相互垂直的线，在1、3两处分别点测定管和对照管上清液1—2滴。方法是用毛细管在纸上点样，注意斑点不可太大（一般为直径0.5cm）而且每点一滴需干燥后方可再点第二滴，在2、4两处则各加0.1mol/L丙氨酸和0.1mol/L谷氨酸1—2滴。

在滤纸圆心处打一小孔（如铅笔芯大小）另取同类型滤纸约1cm2，下半剪成须状，卷成圆筒，如灯芯，插入小孔（勿使突出滤纸面）。

将层析溶剂放入直径3—5cm的表面皿正中，（表面皿放入直径9cm的培养皿正中）将滤纸平放在培养皿上，灯芯浸入溶剂中，将另一同样大小培养皿反盖上，可见溶剂沿灯芯上升到滤纸，在向四周扩散，约25min后，溶剂前缘距滤纸边缘约1cm时即可取出，在60℃烘箱中烤干。

4.显色：将上述滤纸平放在培养皿上，喷上0.5%茚三酮溶液，使滤纸全部润湿再在60℃烘箱干燥之，此时可见紫色斑出现，比较色斑的位置及色泽深浅，计算Rf值，分析是否发生了转氨基反应。

（四）注意事项

第一，操作中接触滤纸前要洗手擦净，并尽量避免手与滤纸中间部位接触。

第二，点样点不宜过大，直径小于0.5cm。

（五）实验结果

显色数天后，发现显色条带继续扩散，1号位中间原本清晰的条带已经模糊了，且丙氨酸的显色条带脱色严重。

三、讨论分析

（一）确定测定管成分

由式（1）可得实验结果中各色斑Rf计算值如表4。

由上表可得，故对照组中应为丙氨酸显色，测定管两色斑中Rf值分别与丙氨酸和谷氨酸相近，故测定管距原点较远的显色带应为丙氨酸，距原点较近的显色带应为谷氨酸。

进一步分析，测定管是在37肝匀浆加入丙氨酸，而肝匀浆中的转氨酶能将丙氨酸的氨基转移至-酮戊二酸，生成谷氨酸，当反应终止时，丙氨酸并未完全反应，故测定管中显色带有两条，分别为丙氨酸与谷氨酸。由于谷氨酸的侧链为-COOH，增大了氨基酸的极性，使其在水中分配系数较大，更倾向于与固定相结合，故移动程度不大，Rf值较小；丙氨酸的侧链为-CH3，疏水亲脂，所以在流动向中分配系数较大，更容易随流动相往前移动，Rf值比谷氨酸大。

（二）异常现象探讨及改进建议

1.显色带异常蝴蝶状现象。由表1中实验结果图可见，该实验所得5条显色带均为蝴蝶状，而非正常弧形，这会给实验Rf值的确定带来误差。由图不难发现，每条显色带向外伸出部分均位于圆形滤纸折痕处，故笔者分析，是由于滤纸中折痕的存在影响了固定相及流动相在滤纸上流动的速度，造成折痕处与周围处液相流动不均，使显色带呈蝴蝶状。由此可推测，在该创新实验进行过程中，滤纸应平整无折痕，以避免造成实验Rf值测定出现误差。

2.显色后条带擴散现象。由表2中图可对比得：在加入显色剂后，显色带仍在缓慢扩散，以致最开始测定组中清晰白色间隔消失。实验证明，在显色后一段时间内，继续扩散现象尤为明显，常导致测定组的两条显色带融为一条，使实验结果不明显，且影响Rf值的测定。

笔者分析，该实验的显色剂为茚三酮，在显色时，加入的茚三酮与水混合，不易挥发，在整个圆形滤纸上均有残留，但分离后的显色带会继续随着溶剂的蒸发而扩散，扩散过程中与残留在滤纸上的茚三酮反应，导致显色条带移动扩大。

故，做该纸层析实验时，选择的显色剂应尽量与水不混合且挥发性大，若显色剂无法满足上述条件，则应在显色之后立即测定Rf相关参数，并照相记录或加入相应稳定剂保存。

3.拖尾现象。由表3可见，对比组存在明显拖尾现象，而拖尾是纸层析中经常出现的现象。造成拖尾的原因众多，最主要的原因可能有点样量过大、展开剂不合适、展开温度不适、展开湿度不适等。笔者将点样量对实验结果的影响做了进一步分析，具体分析如下。

笔者在另一滤纸上滴了不同量的丙氨酸（均是每一滴晾干之后再滴下一滴）。实验结果如表5。

同理，可计算该补充实验各显色带Rf值。

由上两表可得，在本次实验中，丙氨酸用量在1—4滴范围内（保证每次点样直径小于0.5cm），均未出现拖尾现象，同时也通过计算不同用量色斑Rf值可得Rf值与溶剂用量无关。

通过补充实验，笔者认为，可以排除在点样1—4滴内，点样用量对丙氨酸色斑造成拖尾现象的影响，故推测造成丙氨酸拖尾的原因更有可能是点样直径过大，或展开剂配比未达要求，展开剂未饱和等，但具体这些因素如何对色斑移动产生影响，以及这些因素对谷氨酸色斑产生的影响是否与丙氨酸相同等问题都有待进一步实验证明。在这些因素的具体影响未明了的情况下，实验者点样时应尤其注意样点直径，按照实验要求配置溶液，并待展开剂饱和展开装置后再展开。

四、结语

综上所述，运用以流动液体为固定相的纸层析法分离氨基酸能极大地提高实验的简便性，能简单有效地实现物质分离，但分离过程中应注意细节，如保证滤纸的平整、选取适当显色剂、显色之后立刻拍照保存、控制点样直径、把握展开剂配比等，以提高实验的可行性与实验结果的说服力。

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