补体C3和C4表达水平与早期非小细胞肺癌老年肥胖患者临床病理特征及预后的相关性分析

芦翼飞 任中海 王 磊 贾彦巍

非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)占肺癌总数的80%以上，NSCLC的5年生存率低于15%，预后较差[1]。目前，NSCLC的诊断标志物主要是细胞角蛋白19片段，糖类抗原125和50等，但上述几种标志物对患者预后评价效果仍不能满足临床需求[2]。

肥胖是炎症系统的慢性激活，而肥胖与肿瘤的交互作用关系更是受到广泛关注。美国1/7的男性、1/5的女性癌症及欧盟国家4%的男性癌症及7%的女性癌症的发生均与肥胖有关[3]。补体是炎症过程中不可或缺的，对先天性感染具有先天免疫力[4]。鉴于补体系统与炎症之间的潜在联系，一些补体成分可能在与炎症相关的致癌作用中发挥作用。此外，补体激活可通过直接促进肿瘤细胞裂解或补体依赖性细胞毒性途径，从而发挥对癌症的先天免疫[4]。补体C3是三种补体激活途径的收敛点；C4是补体经典激活途径中另一重要组分。补体C3与C4在上皮性卵巢癌[5]，胃癌[6]，舌鳞状细胞癌[7]等多种肿瘤的研究已有报道。目前，NSCLC患者肿瘤组织中补体C3与C4蛋白水平的定量检测尚未见报道。本研究旨在探究早期NSCLC组织中补体C3和C4表达水平与老年肥胖患者临床病理特征及预后的相关性。

1 材料与方法

1.1 研究对象

收集2018年2月到2019年8月行手术的Ⅰ～Ⅱa期NSCLC患者(年龄≥50岁)癌组织及癌旁组织共120例。NSCLC的分期依据2018年美国国立综合癌症网络(national comprehensive cancer network，NCCN)指南第5版[8]。120例患者中位年龄为63岁，年龄为50～78岁，平均年龄为(59.8±4.7)岁；男性84例，女性36例；鳞状细胞癌68例，腺癌28例，大细胞癌24例；高分化72例，中分化20例，低分化28例。本研究组织样本及临床资料的获取经医院伦理会批准，所有患者均签署知情同意书。计算患者体重指数(Body Mass Index，BMI)(kg/m2)。依据BMI的三分位数将患者分为低、中、高BMI三组。

1.2 随访

于术后对120例患者进行24个月电话随访或门诊随访，随访日期截止至2021年9月。

1.3 Wb法检测组织补体蛋白C3和C4含量

低、中、高BMI三组各取4对NSCLC癌组织及癌旁组织制备细胞总蛋白，进行SDS-PAGE凝胶电泳。以C3和C4单克隆抗体为一抗(兔源性单抗)，辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG抗体为二抗，检测C3和C4蛋白的表达，以GAPDH为内参照。同时，Wb法检测癌组织炎症因子CRP水平。

1.4 免疫组织化学法检测

取NSCLC患者组织病理石蜡切片，使用5%血清进行室温封闭40 min，然后加入单克隆抗体C3和C4(兔源性单抗)，碱性磷酸酶(羊抗兔性)二抗4 ℃孵育。磷酸缓冲盐溶液清洗后分别加入SP和DAB恒温显色封片。按阳性细胞百分比(%)及阳性细胞染色强弱进行免疫组化评分。

1.5 统计学分析

2 结果

2.1 低、中、高BMI三组基本资料比较

低、中、高BMI三组年龄、性别、吸烟史、饮酒史等比较无统计学意义(P>0.05)，组间具有可比性，见表1。

表1 低、中、高BMI三组基本资料比较(例，%)

2.2 不同BMI患者癌组织及癌旁组织中C3和C4免疫组织化学结果

如表2所示，与癌旁组织相比，低、中、高BMI三组癌组织中C3和C4蛋白免疫组化评分逐渐增高(P<0.05)。

表2 C3和C4蛋白的免疫组化评分分)

2.3 不同BMI患者癌组织及癌旁组织中C3和C4的蛋白表达水平及CRP水平

低、中、高BMI3组各取4例NSCLC癌组织及4例癌旁组织应用WB技术检测蛋白表达水平，如表3和图1所示，与癌旁组织相比，低、中、高BMI三组癌组织中C3和C4蛋白表达水平逐渐增高(P<0.05)。同时CRP水平随着BMI增高逐渐增高(P<0.05)。

图1 低、中、高BMI三组癌组织及癌旁组织中C3和C4的蛋白表达水平

表3 不同BMI患者癌组织及癌旁组织中C3和C4的蛋白表达水平

2.4 C3和C4蛋白水平与NSCLC临床病理特征的关系

C3和C4蛋白水平与NSCLC患者年龄、性别和组织学类型等无相关性(P>0.05)，而与肿瘤分化程度(C3：γ=0.688，P<0.001；C4：γ=0.577，P<0.001)和BMI(C3：γ=0.603，P<0.001；C4：γ=0.590，P<0.001)呈线性关联，且C3和C4蛋白在低分化和高BMI组患者中的水平增高最显著，见表4。

表4 C3和C4蛋白水平与NSCLC临床病理特征的关系

2.5 癌组织中C3和C4蛋白水平与NSCLC预后的关系

经24个月随访，共56例患者死亡，无失访。依据C3和C4蛋白免疫组织化学水平中位数，将患者分为高、低组。相比低C3组与低C4组，高C3组(χ2=17.564，P<0.001，图2A)和高C4组(χ2=9.767，P<0.001，图2B)累积生存率均显著降低；随着BMI增高，患者的累积生存率逐渐降低(χ2=14.879，P<0.001，图2C)。

图2 癌组织中C3和C4蛋白水平与NSCLC预后的关系

3 讨论

虽然近年来关于NSCLC的临床诊疗有了显著发展，但患者的5年生存率仍维持在较低水平。肥胖体质促进机体炎症系统的慢性激活[9]。炎症被认为可促进癌症发生，越来越多的研究旨在寻找与炎症相关的肿瘤标志物，以提供更好的癌症预后策略[3-4]。补体是针对非自身细胞或不良宿主元素的第一防御系统，也是参与机体炎症反应的重要系统，被认为与癌症进展相关的生物学过程有关。本研究就补体系统C3和C4在NSCLC癌和癌旁组织中的差异表达分析，旨在找寻NSCLC预后评估的有效分子标志物。

多篇研究指出，补体C3与癌症间存在作用关系。Zhang等[10]发现外源性C3体外增强可促进胰腺癌细胞的增殖和活性。Farrokhi Yekta等[11]的研究发现，乳头状甲状腺癌中补体C3表达增加，进一步分析表明C3触及的补体激活级联反应参与了甲状腺癌的发病机制。上述研究提示，C3的差异表达通过干扰机体炎症反应程度参与肿瘤的发生、发展过程。C4是另一个重要的补体，报道指出高血清水平的补体C4和C3可作为骨髓瘤骨病的新标志物[12]。Ajona 等[13]指出总之，支气管液中C4的持续升高，有助于对肺癌的早期诊断，在鉴别健康人时的曲线下面积达到0.7。然而，关于C3和C4在老年肥胖NSCLC患者组织中的表达水平，及其与NSCLC生物学功能的相关性和患者预后评估的价值尚未见报道。

本研究发现，与癌旁组织相比，低、中、高BMI三组癌组织中C3和C4蛋白水平逐渐增高。此外，C3和C4免疫组织化学水平与患者的分化程度和BMI呈线性关联，且C3和C4蛋白在低分化和高BMI组患者中的水平增高最显著，提示两者与NSCLC癌的不良预后密切相关，且在不同BMI患者中存在差异，同时，我们对CRP水平检测也证实了炎症因子CRP随着BMI的增高在增加。我们分析可能的原因包括：①早前报道指出，超重或肥的人被诊断为癌症时，他们的肿瘤会更大，比BMI在25以下的人平均高出33%[14]；②报道指出BMI较高的患者炎症因子水平更高，更易促进癌细胞增长[15]；③对BMI高者使用标准剂量药物治疗时，可能会使药物不足或者分布不均[16]。相比低C3组与低C4组，高C3组和高C4组累积生存率均显著降低，而随着BMI增高，患者的累积生存率也逐渐降低。同时，对于C3与C4水平差异仍处在部分混杂因素，由于C3与C4的水平波动伴随着体内免疫反应及蛋白含量的波动而变化，对于营养不良或者肾脏疾病等患者，即使早期临床病症不明显而没有得到临床确诊或者患者忽视检查最终进入到试验阶段，仍会对C3、C4水平产生错误估低。

本次研究发现早期NSCLC癌组织中C3和C4蛋白水平与患者分化程度和BMI相关，且高C3和C4蛋白水平均提示NSCLC患者预后较差。