幽门螺杆菌感染对胃癌组织miR-146a表达及胃癌恶性进展的影响

常永欣 王 鑫 唐照鹏

胃癌为常见消化道肿瘤，发病率与病死率均较高，目前具体发病机制尚不明确，与遗传、饮食习惯、消化疾病、幽门螺杆菌感染等因素有关，其中幽门螺杆菌感染为公认的胃癌重要诱因[1-2]。分子生物学显示胃癌发病与凋亡基因失调、抑癌基因失活、致癌基因激活有关，小分子RNA(miRNA)为相对保守且非编码的单链RNA，经降解mRNA或抑制转录能调节基因表达[3-4]。研究显示[5]，miR-146a可参与免疫反应，对多种肿瘤增殖、转移、凋亡过程具有一定作用，目前关于miR-146a在胃癌中研究较少[6]。为此，本研究探讨了幽门螺杆菌感染对胃癌组织miR-146a表达情况及对胃癌恶性进展的影响，报告如下。

1 材料与方法

1.1 一般资料

选取2019年5月至2021年5月我院收治的82例胃癌患者，其中男性49例，女性33例；年龄为38～70岁，平均(49.68±8.71)岁。纳入标准：符合《胃癌诊治难点中国专家共识(2020版)》标准[7]，且经术后病理检查确诊为胃癌；无幽门螺杆菌根除史；无手术与放化疗治疗史；签署知情同意书。排除标准：合并其他恶性肿瘤患者；合并高血压、糖尿病等慢性疾病患者；严重心肝肾功能不全患者；妊娠或哺乳期妇女；精神疾病或意识障碍患者。患者术后进行病理取材，检测肿瘤类型、大小、分化程度、TNM分期与淋巴结转移；并对术后切除胃癌组织进行幽门螺杆菌检测，根据感染情况将患者分为阳性组(n=54例)与阴性组(n=28例)。阳性组男性32例，女性22例；平均年龄为(50.16±9.02)岁。阴性组男性17例，女性11例；平均年龄为(49.72±8.67)岁。2组资料差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2 方法

1.2.1 幽门螺杆菌感染检测方法 患者检查前均无抗菌素与制酸药等服用史，于术后的病理标本切除后取适量胃癌组织及癌旁组织进行检测，生理盐水清洗后将组织用改良Giemsa染色玉快速尿素酶试验法测定幽门螺杆菌，两试验均呈阳性则表示幽门螺杆菌感染，反之则无幽门螺杆菌感染[8]。

1.2.2 组织处理 将患者组织标本于手术切除后半小时内常规固定、包埋，制备切片进行HE染色观察，免疫组化检测幽门螺杆菌表达。

1.2.3 提取组织标本中RNA 抽提多张组织标本切片，参照说明书进行：(1)取出组织样品中石蜡，于液氮内研磨后移入离心管，加入二甲苯混合；(2)组织与二甲苯混合后加热，融化石蜡；(3)室温下离心2 min，将组织沉淀去除二甲苯；(4)加入乙醇洗涤，室温下离心除去乙醇，再重复1次洗涤；(5)干燥，沉淀中加digestion buffer与protease混匀，置于50 ℃、80 ℃中15 min，离心后吸取上清液移入新离心管；(6)加入isolation additive与乙醇混匀；(7)使用过滤柱过滤裂解，离心去除滤液；(8)过滤器内加洗涤液离心，抛弃管中内滤液；(9)洗涤液反复洗涤2次过滤柱，离心去除残存液体；(10)过滤柱转移至新收集管，加入洗脱液于过滤柱上，室温下静置半小时；(11)过滤器内加入洗涤液；室温静置30～60 s，离心；(12)再次洗涤过滤柱2次，离心去除残液；(13)转移柱子于另一收集管，加洗脱液静置，离心得到RNA；(14)通过紫外分光光度计测量吸光度，琼脂糖凝胶电泳检测其RNA完整性。

1.2.4 qRT-PCR检测miR-146a表达 RNA逆转录：①于EP管中加总RNA与oligo，再加DEPC水混匀，离心；②于PCR仪温浴5 min后再冰浴3 min；③配制RT反应体系，在EP管内加dNTP mix、reaction buffer、ribolock rnase inhibitor、revertAid m-mulv reverse transcriptase；④反应体系温水水浴1 h后，于70 ℃下水浴5 min使RT酶发生失活；⑤逆转录为cDNA，冷冻保存。定量检测PCR：①去除cDNA为模板，配置PCR反应体系；②高温下预变性5 min，再变性10 s；③于60 ℃下退火延伸30 ℃，扩增循环，于60 ℃下延伸采集荧光；结束后得到样本CT值[9]。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 患者miR-146a表达情况

阳性组胃癌组织miR-146a表达水平高于阴性组(P<0.05)。见图1。

图1 组织miR-146a表达水平

2.2 幽门螺杆菌感染与胃癌恶性程度关系

幽门螺杆菌感染阳性组与阴性组患者在肿瘤类型方面无统计学意义(P>0.05)；幽门螺杆菌感染与胃癌患者肿瘤大小、分化程度、TNM分期、淋巴结转移有关(P<0.05)。见表1。

表1 幽门螺杆菌感染与胃癌恶性程度关系/例

2.3 胃癌恶性进展的危险因素

经Cox比例风险回归模型多因素分析显示，幽门螺杆菌感染与淋巴结转移为影响胃癌恶性进展的危险因素(P<0.05)。见表2。

表2 多因素Cox比例回归模型分析胃癌恶性进展

3 讨论

胃癌具有高侵袭性与转移率，患者存活率低。随着如今生活水平提高、饮食结构与生活习惯的改变，胃癌发病率逐年上升且具有年轻化趋势。多数胃癌患者确诊时已为中晚期，传统手术疗效不佳，术后复发和转移率较高，5年生存率低于50%[10-11]。故确定胃癌发生发展机制，可为早期防治提供参考依据。

胃癌发生发展为长期多因素影响作用结果，与遗传、饮食习惯、消化疾病、幽门螺杆菌感染等因素有关，其中幽门螺杆菌感染为公认的胃癌重要诱因。研究显示[12]，胃炎、胃溃疡等疾病中均能检测出幽门螺杆菌，持续幽门螺杆菌感染可导致肠上皮化生、胃黏膜萎缩等，进而发展为胃癌。幽门螺杆菌多寄居在胃窦黏膜小凹中，该部位常发生肠上皮化生、不典型增生，是胃癌发病率最高部位。长期幽门螺杆菌慢性感染可使胃黏膜细胞分泌炎症因子，进而引发粒细胞与淋巴细胞出现浸润，局部产生慢性炎症，并使胃黏膜萎缩或不典型增生[13-14]。故幽门螺杆菌感染为胃癌发病的危险因素。幽门螺杆菌感染导致胃癌发生为临床公认，但其感染与胃癌恶性进展关系尚存在争议。miRNA 为内源性非编码调控小分子RNA家族，在真核生物中广泛存在，多种细胞生物基因组编码。miRNAs参与多种生理病理过程，其中miRNA在肿瘤中研究最活跃[15]。多项研究表明miRNA参与细胞增殖分化、凋亡等多种肿瘤发生发展的生物学过程，其异常表达与肿瘤发生发展和患者预后有关。miR-146a位于第5号染色体上，对细胞生长分化与存活等生命过程有影响作用，与肿瘤发生发展密切相关[16-17]。rs2910164位于miR-146a前体序列上，碱基G>C突变使茎环区配位错乱。体外研究显示，pre-miR-146a序列中C等位基因对应G等位基因，pre-与成熟的miR-146a量均降低，C等位基因干扰核因子结合pre-miR-146a[18-19]。多种癌细胞株证实SNP对成熟miR-146a表达有一定影响，包括胃癌、甲状腺癌、卵巢癌等。miR-146a变异与胃癌关系的研究集中于发病风险。不同研究的miR-146a基因型与胃癌发病风险关系有一定差异，但多数研究显示GG基因型会提高胃癌发病风险。正常组织与癌旁组织中的miRNA表达具有显著差异，差异表达可能为癌基因或抑癌基因在肿瘤发生中作用。miR-146a为miRNA成员，为癌基因或抑癌基因，能发挥不同生物学作用[20]。miR-146a于胶质瘤内表达低于癌旁正常组织，胃癌组织中表达也类似，但在甲状腺癌中发表达上调。本研究胃癌组织中miR-146a表达下调。肿瘤细胞分化程度不同，其miRNA表达量也不尽相同。miR-146a在高分化细胞中表达最高，低分化癌细胞中表达量最低，说明miR-146a表达与肿瘤分化严重程度有关[21-22]。

细胞增殖凋亡为生物体生长发育与繁殖过程中必须的环节，但当细胞增殖发生失控，机体本身正常机制被扰乱而诱发肿瘤。过表达miR-146a对胃癌细胞迁移有抑制作用，下调miR-146a能提高癌细胞迁移力[23-24]。本研究证实miR-146a对胃癌细胞增殖凋亡有一定影响。将miR-146a mimics与miR-146a control转染至胃癌组织中，显示转染miR-146a mimics细胞增殖低于miR-146a control，其凋亡率高于miR-146a control，提示转染miR-146a模拟物能抑制细胞增殖，对其凋亡具有促进作用[25-26]。细胞凋亡受多基因调控，促凋亡蛋白Bax与抗凋亡蛋白Bcl-2为重要蛋白，Bax上升能使细胞凋亡，当Bcl-2上升可降低细胞凋亡率。故研究提出细胞凋亡与Bax和Bcl-2比率相关，当该蛋白比率上调可抑制细胞凋亡，反之促进细胞凋亡。幽门螺杆菌感染促进胃癌侵袭与转移机制不明确，可能与miR-146a高表达有关[27-28]。

综上所述，幽门螺杆菌感染对胃癌组织miR-146a表达具有上调作用，能促进胃癌侵袭转移能力，可为临床早期防治胃癌提供参考依据。