发酵盐厌氧菌YL9-2对鱼露发酵过程中品质和风味的改善作用

李文静，李春生, ，王悦齐, ，陈胜军, ，赵永强, ，吴燕燕, ，李来好,

1. 中国水产科学研究院南海水产研究所/农业农村部水产品加工重点实验室/国家水产品加工技术研发中心，广东 广州510300

2. 大连工业大学/海洋食品精深加工关键技术省部共建协同创新中心，辽宁 大连 116034

鱼露又称鱼酱油，是一种以低值鱼类或水产品加工副产物为原料、经过长时间自然发酵制得的风味独特的水产调味品[1]。鱼露色泽呈琥珀色，味道鲜美，富含牛磺酸、人体必需氨基酸、有机酸和微量元素[2]，是东南亚地区和我国南方沿海一带最受欢迎的调味品之一[3-5]。传统的鱼露发酵工艺通常采用高盐盐渍 (加盐量一般为20%～30%) 的自然发酵方式[6]，在微生物和鱼体内源酶的协同作用下，对鱼体中的蛋白质、脂质等营养成分进行发酵分解。由于完全依靠自然发酵，其生产周期长，一般需要1～3年，经济效益低。因此，如何缩短鱼露发酵周期，加快发酵速度，是目前鱼露生产企业亟待解决的重要难题。

添加微生物发酵剂是鱼露快速发酵常用的方式[7-8]。目前，应用于鱼露快速发酵的菌株大部分分离自传统发酵鱼露，如枝芽孢杆菌属 (Virgibacillus)[9]、动性球菌属 (Planococcus)[10]、盐杆菌属 (Halobacterium)[11]、葡萄球菌属 (Staphylococcus)[12]、四联球菌属 (Tetragenococcus)[13]等。但是由于目前微生物发酵剂筛选的盲目性，大多选用的菌株不是对传统发酵鱼露风味和品质形成起关键作用的菌株，因此虽然鱼露发酵速度有所提高，但失去了传统鱼露的特征风味，难以进行产业化应用。前期研究发现，盐厌氧菌属 (Halanaerobium)、盐单胞菌(Halomonas)、四联球菌属、盐球菌属 (Halococcus)等微生物菌群在我国传统发酵鱼露风味形成过程中起着关键作用，特别是盐厌氧菌属在鱼露发酵过程中长期处于较高的丰度[14]。此外，盐厌氧菌属也被证明是韩国鱼露[15]和泰国鱼露[16]品质以及风味形成的关键微生物菌群。目前尚未见有关鱼露中盐厌氧菌的筛选及应用于鱼露快速发酵的报道。本研究根据盐厌氧菌属的生理生化特性，利用筛选培养基从鱼露发酵液中定向筛选盐厌氧菌，采用16S rRNA基因测序及系统发育树分析确定具体的种属信息。通过加菌发酵的方式，研究鱼露发酵过程中氨基酸态氮、生物胺、挥发性风味物质的变化规律，评价发酵菌株对鱼露品质、风味和食用安全性的影响作用，以期为鱼露专用发酵菌剂的开发提供重要技术支持，促进我国传统鱼露发酵产业转型升级。

1 材料与方法

1.1 菌种

发酵盐厌氧菌 H. fermentans 菌株YL9-2，分离自汕头鱼露厂有限公司的传统鱼露发酵液。

1.2 培养基

改良的LB平板组成：蛋白胨10 g、酵母浸粉5 g、氯化钠100 g、琼脂20 g，10%鱼露发酵液1 000 mL，pH 7.0。

改良的LB液体培养基组成：蛋白胨10 g、酵母浸粉5 g、氯化钠100 g，10%鱼露发酵液1 000 mL，pH 7.0。

1.3 菌株的分离纯化和分子生物学鉴定

将发酵9个月的鱼露发酵液在无菌条件下过滤，在改良的LB平板上涂布不同梯度稀释倍数(10～106) 的发酵液，35 ℃厌氧培养3 d，挑取生长良好的菌落，在改良的LB平板上进行分离纯化，挑取单菌落接种至改良的LB液体培养基中，35 ℃厌氧培养2 d后，液体培养基呈黄色浑浊状态，取菌液于4 ℃、12 000×g 离心10 min得到YL9-2菌体，进行后续鉴定。

菌株YL9-2的分子生物学鉴定采用16S rRNA基因测序 (北京六合华大基因科技有限公司)。将菌株YL9-2的16S rRNA基因序列在NCBI 上比对分析，初步确定所属的菌属。在EzBioCloud数据库中选择相同属内标准菌株的16S rRNA基因序列，使用 Clustal W进行多序列对比选择，选择邻位相连法 (Neighbor-Joining) 构建菌株的系统发育树，并使用基于1 000次重复的自展值分析系统发育树的可靠性[17]。

1.4 鱼露加菌发酵

冰鲜蓝圆鲹 (Decapterus maruadsi) 购自广州市华润万家 (客村店)，整鱼用绞肉机绞碎，按质量比为20%加入食盐，混匀后备用。将菌株YL9-2厌氧培养3 d，于4 ℃、12 000×g 离心10 min，无菌生理盐水重悬，将菌体按106CFU·g-1的终浓度加至预处理过的原料中，搅拌均匀。向原料中加入相同体积的生理盐水作为对照，用于鱼露的自然发酵。加菌发酵组 (H) 和自然发酵组 (N) 在35 ℃下保温发酵，分别取发酵10、15、30和45 d的鱼露发酵液，于4 ℃、12 000×g 离心15 min，取上清液进行后续分析。

1.5 氨基酸态氮分析

根据GB 5009.235—2016《食品安全国家标准食品中氨基酸态氮的测定》中的电位滴定法并稍作修改。取1.0 mL鱼露发酵上清液，超纯水定容至100 mL，混匀备用。采用瑞士万通公司的809 Titrando型自动电位滴定仪测定氨基酸态氮质量浓度。设置电位滴定仪自动加甲醛5 mL，固定氨基的碱性，使羧基显示出酸性后，用氢氧化钠 (Na-OH) 滴定，根据碱液消耗量计算样品中氨基酸态氮含量。

1.6 生物胺分析

取1.0 g鱼露发酵上清液，加入3 mL 0.1 mol·L-1的 HCl混匀，4 ℃、8 000 r·min-1离心 10 min，取上清液定容至5 mL，制成生物胺提取液。取1.0 mL生物胺提取液，加入1.5 mL 磷酸盐缓冲液 (pH=11)，加入1mL Dns-Cl，在40 ℃水浴锅中避光反应1 h。加入0.2 mL脯氨酸混匀，室温反应1 h后，加入3.0 mL正庚烷混匀。待液体分层后取1 mL上层液，氮气吹干，用1 mL色谱级甲醇溶解备用。利用日本岛津公司的高效液相色谱仪LC-20AD检测样品中的生物胺浓度，色谱柱为反相色谱柱ChromCoreTMC18 (4.6 mm×250 mm, 5 μm)，设置柱温为30 ℃，将45%超纯水和55%甲醇作为流动相平衡色谱柱，设置进样体积为20 μL。紫外检测波长254 nm，随后以0.8 mL·min-1的流速进行梯度洗脱，洗脱程序参考于金芝等[18]的方法。根据8种生物胺的保留时间和峰面积，对鱼露中的生物胺进行定量分析。

1.7 挥发性风味物质分析

采用顶空固相微萃取气质联用 (HS-SPME-GCMS) 技术分析鱼露发酵液中的挥发性风味物质[1]，并稍作修改。取5.0 g鱼露发酵上清液，置于20 mL顶空进样瓶中，加入2 μg内标物2,4,6-三甲基吡啶，用PTFE-硅胶垫瓶盖迅速封闭瓶口，插入已老化好的DVB-Car-PDMS三相萃取头，置于60 ℃的磁力搅拌台上，吸附40 min，再插入GC-MS进样口进行解析，进样口温度为250 ℃，解析5 min，重复测定3次。为防止样品间交叉污染，连续进样的萃取头需要在270 ℃的条件下老化 10 min。采用美国安捷伦公司的6890-5973型GC-MS来检测样品中的挥发性风味物质。色谱柱采用美国安捷伦公司的 HP-5MS色谱柱 (60 m×0.25 mm, 0.25 μm)，载气为氦气，流速为1.5 mL·min-1(恒线速度)。分流比1∶5，GC-MS的初始温度为50 ℃，持续3 min，然后以速率为5 ℃·min-1将温度提高至100 ℃，持续 2 min。以 8 ℃·min-1升温至 180 ℃，并保持2 min，再以5 ℃·min-1升温至250 ℃，并保持25 min。离子源温度为200 ℃。质量扫描范围为35～550 m·z-1，电子能量为70 eV。

挥发性风味化合物由Xcalibur软件系统完成，利用计算机检索各化合物，与WILEY和NIST数据库相匹配，当化合物的正反匹配度大于800才予以报道。

各挥发性风味化合物的含量计算公式为：

式中：C为各挥发性化合物的质量分数 (mg·kg-1)；Ax为各挥发性化合物的峰面积；Ai为内标物的峰面积；m为内标物2,4,6-三甲基吡啶的质量 (μg)；M为称取的鱼露样品质量 (g)。

气味活性值(Odor activity value, OAV)为各个挥发性风味物质的含量与其阈值的比值，计算公式为：

式中：C为各挥发性挥发性化合物的质量分数(mg·kg-1)；T 为各挥发性风味的阈值 (mg·kg-1)。

1.8 统计分析

2 结果与分析

2.1 菌株的分子生物学鉴定

在NCBI中将菌株YL9-2的16S rRNA基因序列比对分析后发现，其与多种盐厌氧菌属的菌株相似度较高。选择到目前为止合格发表的全部盐厌氧菌属标准菌株的16S rRNA基因序列与YL9-2的16S rRNA基因序列构建系统发育树 (图1)。经计算，菌株YL9-2的16S rRNA基因序列与发酵盐厌氧菌 (H. fermentans) R-9的距离最近, 两者同源性为99.93%，由此确定所分离的菌株YL9-2为发酵盐厌氧菌，重新命名为H. fermentans YL9-2。

图1 利用邻位相连法构建的菌株YL9-2的系统发育树Fig. 1 Systemic phylogenetic tree of strain YL9-2 constructed using Neighbor-Joining method

2.2 发酵盐厌氧菌YL9-2对鱼露氨基酸态氮质量浓度的影响

氨基酸态氮的含量是鱼露最主要的品质指标之一，氨基酸态氮含量越高，表明鱼露的品质越高、鲜味越好。添加发酵盐厌氧菌对不同发酵时间下鱼露发酵液中氨基酸态氮质量浓度的影响见图2。结果显示，随着发酵时间的增加，加菌发酵和自然发酵鱼露中氨基酸态氮质量浓度均显著增加。与自然发酵鱼露相比，添加发酵盐厌氧菌能够显著增加鱼露中氨基酸态氮的质量浓度，其中发酵10 d鱼露的氨基酸态氮质量浓度可达10.3 g·L-1，根据中国鱼露行业标准 (SB/T 10324—1999)，该鱼露超过一级鱼露的氨基酸态氮标准；此时，自然发酵鱼露的氨基酸态氮质量浓度仅为7.3 g·L-1，为二级鱼露。自然发酵鱼露达到一级鱼露氨基酸态氮的要求需要发酵30 d，而达到加菌发酵10 d鱼露的氨基酸态氮需要45 d。结果表明，添加发酵盐厌氧菌能够加速鱼体蛋白质的分解，促进游离氨基酸的形成，对于鱼露品质的形成具有重要作用。

图2 添加发酵盐厌氧菌对不同发酵时间下鱼露发酵液中氨基酸态氮质量浓度的影响Fig. 2 Effect of H. fermentans YL9-2 addition on amino acid nitrogen mass concentration in fish sauce at different fermentation time

2.3 发酵盐厌氧菌YL9-2对鱼露生物胺质量分数的影响

生物胺广泛存在于发酵食品中，主要是由游离氨基酸在微生物产生的氨基酸脱羧酶催化下脱羧基形成的[6,19]。过量摄入生物胺可导致头痛、皮疹、腹泻、呕吐等中毒症状[20]。生物胺也是我国鱼露中重要的质量安全评价指标，控制生物胺对于提升鱼露的品质具有重要意义。有研究发现，传统自然发酵鱼露中含有较高的组胺、酪胺、腐胺和尸胺[20]，与本研究结果相似，组胺、酪胺、腐胺和尸胺是鱼露发酵过程中含量较高的生物胺，而亚精胺、精胺、色胺和苯乙胺的质量分数相对较少(图3)。在自然发酵鱼露中，随着发酵时间的增加，大部分生物胺包括组胺、酪胺、亚精胺、精胺、色胺的质量分数先上升后下降，腐胺和尸胺呈现逐渐上升的趋势，而苯乙胺则逐渐下降；与大部分生物胺的变化趋势一致，总生物胺的质量分数也呈现先上升后下降的趋势，这与传统发酵鱼露中生物胺的变化趋势类似[20]。在加菌发酵组中，除色胺和苯乙胺外，其他生物胺以及总生物胺与自然发酵组表现出相似的变化趋势。与自然发酵相比，添加发酵盐厌氧菌能够显著降低鱼露中大部分生物胺的含量。组胺和酪胺被认为是发酵食品中毒性最大的生物胺[21]，其中组胺根据国际食品法典 (CODEX STAN 302—2011) 规定在鱼露中的限量标准为400 mg·kg-1。本研究发现，自然发酵组和加菌发酵组在整个发酵过程中组胺质量分数均低于限量标准，而且添加发酵盐厌氧菌后在发酵末期 (45 d)鱼露中组胺的质量分数下降了26.4%；同时，酪胺的质量分数下降了27.1%。腐胺和尸胺是评价鱼制品新鲜度和微生物变质程度的重要指标[22]。虽然腐胺和尸胺本身没有毒性，但其可以通过抑制组胺代谢酶的活性来增强组胺的毒性，并能与亚硝酸盐反应形成致癌化合物亚硝胺[23]。本研究中，利用发酵盐厌氧菌加菌发酵后，鱼露发酵末期的腐胺和尸胺的质量分数分别下降了9.4%和39.8%。此外，精胺的质量分数在加菌发酵后显著下降，在发酵末期下降了69.4%。总生物胺质量分数在发酵末期由自然发酵的808.0 mg·kg-1下降至加菌发酵的599.3 mg·kg-1，显著下降了25.8%。结果表明，发酵盐厌氧菌的添加可能通过抑制产胺微生物的繁殖来减少鱼露生物胺的形成，这对于鱼露质量安全的提升具有重要作用。

图3 添加发酵盐厌氧菌对不同发酵时间下鱼露发酵液中生物胺质量分数的影响Fig. 3 Effect of H. fermentans YL9-2 addition on biogenic amine mass fraction in fish sauce at different fermentation time

2.4 发酵盐厌氧菌YL9-2对鱼露挥发性风味物质的影响

气味作为水产品重要的感官评价因素，决定消费者对水产品的第一感觉和接受程度。目前，大部分挥发性化合物与其气味描述之间的关系已被揭示。通过对挥发性化合物的鉴定，可以评价不同发酵组间鱼露气味的差异。自然发酵和加菌发酵过程中鱼露挥发性化合物的变化结果见图4。利用PLS-DA分析不同发酵组间挥发性化合物的相似度 (图4-a)，在自然发酵组中，发酵15、30和45 d鱼露发酵液中挥发性化合物的相似度较高，但与发酵10 d的差异性较大；而在加菌发酵组中，发酵10、15和30 d鱼露发酵液中挥发性化合物的相似度较高，但与发酵45 d的差异性较大；整体而言，加菌发酵45 d与其他所有发酵组间差异较大。在整个鱼露发酵过程中，两个发酵组共检测出38种挥发性化合物，其中质量分数较高的为醛类、烃类、醇类和呋喃类化合物 (图4-b)。挥发性化合物热图分析(图4-c) 显示，在自然发酵组和加菌发酵组中，大部分挥发性化合物的质量分数随着发酵时间的增加而呈现逐渐上升的趋势，并在发酵末期 (H45和N45) 达到最大。

图4 自然发酵 (N) 和加菌发酵 (H) 过程中鱼露挥发性化合物的变化Fig. 4 Change of volatile compounds in fish sauce during natural fermentation (N) and fermentation with H. fermentans YL9-2 (H)

OAV是香气化合物浓度与其阈值的比值，若OAV≥1则可认为此挥发性物质为主体呈香风味化合物，且OAV 越大对整体香气贡献程度越高。38种挥发性化合物中有12种的OVA≥1 (表1)，说明这12种物质为鱼露中主要的呈香风味化合物，筛选到12种特征性挥发性风味化合物 (图5)。醛类化合物主要是脂质氧化产生，一般具有宜人的气味，如麦芽香、青草味、奶酪味、水果香等[24]。醛类化合物由于自身阈值较低，因此会对食品整体的风味影响较大[25]。本研究中，醛类化合物是鱼露发酵过程中挥发性风味化合物中数量和含量最多的类群，主要包括异戊醛、2-甲基丁醛、己醛、庚醛、辛醛和壬醛，这些化合物在鱼露的自然发酵和加菌发酵过程中大体呈上升趋势，而且添加发酵盐厌氧菌YL9-2能够显著增加鱼露中这些醛类化合物的质量分数，在发酵末期这些挥发性风味化合物的质量分数较自然发酵组分别提高了79.7%、92.5%、45.3%、41.8%、21.2%和29.4%。发酵盐厌氧菌的添加可能促进了脂质的代谢，从而促进了这些醛类化合物的生成。醇类化合物也是鱼露发酵过程中重要的挥发性风味化合物。1-戊烯-3醇具有宜人的果香和蔬菜香味，在自然发酵组中随着发酵时间的延长逐渐增加，而在加菌发酵组中呈现先上升后下降的趋势。1-辛烯-3醇又称蘑菇醇，具有宜人的蘑菇香，被认为是发酵鱼产品中最主要的醇类风味化合物之一[14,26-27]。本研究发现，随着发酵时间的增加，1-辛烯-3醇质量分数呈现增加的趋势，并在发酵末期达到最大。与自然发酵相比，添加发酵盐厌氧菌后，1-戊烯-3醇和1-辛烯-3醇在发酵末期的质量分数分别提高了20.4%和46.6%，对于鱼露整体风味的提升具有重要作用。酮类化合物主要由不饱和脂肪酸氧化和氨基酸降解形成[28-29]。在鱼露发酵过程中，共筛选到2种特征性酮类化合物(2-壬酮和2-十一酮)，其具有较低的阈值，且具有宜人的水果香、甜香和脂肪香，对鱼露整体的风味贡献较大。本研究发现在发酵末期，2-壬酮和2-十一酮在加菌发酵之后的质量分数显著增加，分别提高了67.7%和47.2%。2-乙基呋喃具有豆香、面包香和麦芽香，发酵前期加菌发酵能够显著提高其在鱼露中的生成，但在发酵末期差异不大。三甲胺是鱼类特征性的腥味物质[30]，过高的浓度会对鱼露整体风味产生不利影响。随着发酵时间的增加，自然发酵鱼露中三甲胺呈现逐渐上升的趋势，并在发酵末期达到最大，而添加发酵盐厌氧菌YL9-2能够显著抑制三甲胺在鱼露发酵末期的快速增加，与自然发酵鱼露相比下降了61.7%，这对改善鱼露的挥发性风味起着重要作用。

表1 自然发酵 (N) 和加菌发酵 (H) 过程中鱼露挥发性化合物的气味活性值Table 1 OAV value of fish sauce during natural fermentation (N) and fermentation with H. fermentans YL9-2 (H)

图5 添加发酵盐厌氧菌对不同发酵时间下鱼露发酵液中特征性挥发性风味化合物质量分数的影响Fig. 5 Effect of H. fermentans YL9-2 addition on volatile flavor compound mass fraction in fish sauce at different fermentation time

3 结论

从传统鱼露发酵液中筛选到一株与传统鱼露风味形成相关的关键菌株YL9-2，经16S rRNA基因测序及系统发育树分析，鉴定为发酵盐厌氧菌。发酵盐厌氧菌YL9-2能够显著提高鱼露氨基酸态氮含量，一级鱼露的形成时间从30 d缩短至10 d。发酵盐厌氧菌的添加能够显著降低鱼露中生物胺的形成，特别是组胺、酪胺、腐胺、尸胺和酪胺，在发酵末期分别下降了26.4%、27.1%、9.4%、39.8%和69.4%。在整个鱼露发酵过程中，两个发酵组共检测出38种挥发性化合物，其中含量较高的为醛类、烃类、醇类和呋喃类化合物，根据每个化合物的阈值，筛选到12种特征性挥发性风味化合物，其中在鱼露发酵末期异戊醛、2-甲基丁醛、己醛、庚醛、辛醛、壬醛、1-戊烯-3醇、1-辛烯-3醇、2-壬酮、2-十一酮在加菌发酵后显著增加，2-乙基呋喃变化不大，而三甲胺则显著下降。结果表明，发酵盐厌氧菌YL9-2的添加能够有效改善鱼露的品质和风味，提升鱼露的食用安全性。