非小细胞肺癌患者外周血自然杀伤细胞受体表达及与肿瘤标志物的关系研究

张靖悦，郑光辉，杨常建，闫建强

平煤神马医疗集团总医院肿瘤内科，河南 平顶山 467000

非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是最常见的肺癌类型，约占肺癌总数的80%，由于NSCLC的早期症状不明显，许多患者在就诊时已发展到中晚期，导致预后极差，病死率高[1]，故早期诊断和积极治疗是NSCLC防治的关键。正常生理状态下免疫系统能够清除突变细胞，而NSCLC的发生发展与肿瘤细胞逃避机体免疫监视密切相关[2]。自然杀伤（natural killer，NK）细胞是机体重要的免疫细胞，可直接杀伤肿瘤细胞，其细胞表面包括可激发NK细胞产生杀伤作用的活化性受体[自然杀伤细胞2族成员D（natural killer group 2 member D，NKG2D）、自然杀伤细胞活化性受体p30（natural killer p30，NKp30）、自然杀伤细胞活化性受体 p44（natural killer p44，NKp44）等]和抑制NK细胞杀伤作用的抑制性受体[自然杀伤细胞2族 成 员 A（natural killer group 2 member A，NKG2A）、CD158a、CD158b][3-4]。肿瘤细胞可通过抑制活化性受体的表达及促进抑制性受体的表达，而削弱NK细胞对肿瘤细胞的免疫监视及清除作用[5-6]。肿瘤标志物是肿瘤辅助诊断的新突破，对NSCLC的早期诊断有一定价值[7-8]。因此，本研究拟分析NSCLC患者外周血NK细胞受体的表达及与肿瘤标志物的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2018年1月至2020年12月平煤神马医疗集团总医院收治的NSCLC患者的病历资料。纳入标准：均经病理检查诊断为NSCLC；首次发病；未接受过放化疗等抗肿瘤治疗。排除标准：合并急性感染性疾病；既往有肿瘤病史。根据纳入、排除标准，共纳入122例NSCLC患者作为NSCLC组，其中，男性73例，女性49例；年龄36～85岁，平均（59.68±11.24）岁；病理类型：腺癌62例，鳞状细胞癌41例，大细胞癌19例；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期47例，Ⅲ～Ⅳ期75例。另选取同期在平煤神马医疗集团总医院体检的46例健康体检者作为对照组，其中男性29例，女性17例；年龄32～81岁，平均（61.34±9.46）岁。两组研究对象性别、年龄比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。本研究经医院伦理委员会审批通过，所有患者均知情同意并签署知情同意书。

1.2 检测方法

1.2.1 样本采集采集两组研究对象空腹外周静脉血各两管，每管采集5 ml，其中一管用于外周血NK细胞受体表达检测，需于采集后2 h内检测，另一管用于血清肿瘤标志物水平检测，待离心分离血清后，可于-80℃冰箱保存待测。

1.2.2 外周血NK细胞受体表达检测每个流式管中加入50 μl全血，再加入5 μl anti-CD3-FITC、anti-CD56-APC、anti-CD16-Per CP，然后每管再分别加入5 μl单克隆抗体（anti-NKG2D-PE、anti-NKp30-PE、anti-NKp44-PE、anti-NKG2A-PE、anti-CD158a-PE、anti-CD158b-PE），同时设置阴性对照组，加入相同荧光标记的同种免疫球蛋白。各组样本经充分混匀后，在室温下放置20 min，再加入细胞裂解液室温静置10 min，再加入磷酸盐缓冲液振荡混匀，再用磷酸盐缓冲液洗涤2次，然后使用流式细胞仪进行上机检测。

1.2.3 血清肿瘤标志物水平检测采用酶联免疫吸附法检测两组研究对象血清肿瘤标志物[癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、细胞角质蛋白19片段抗原21-1（cyto-keratin 19 fragment antigen 21-1，CYFRA21-1）、神经元特异性烯醇化酶（neuron specific enolase，NSE）]水平，试剂盒均购自瑞士罗氏公司，实验操作步骤按照试剂盒说明书进行操作。

1.3 统计学分析

采用SPSS 20.0软件处理数据，符合正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组比较采用单因素方差分析，两组比较采用t检验，计数资料以例数表示，相关性分析采用Pearson相关分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 外周血NK细胞受体表达水平的比较

NSCLC组患者NK细胞活化性受体NKG2D、NKp30、NKp44表达水平均明显低于对照组，抑制性受体NKG2A、CD158a、CD158b表达水平均明显高于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.01）。（表1）

表1 两组研究对象外周血NK细胞受体表达水平的比较（%，x-± s）

2.2 不同病理类型及TNM分期NSCLC患者外周血NK细胞受体表达水平的比较

不同病理类型的NSCLC患者外周血NK细胞受体表达水平比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；Ⅲ～Ⅳ期NSCLC患者NK细胞活化性受体NKG2D、NKp30、NKp44表达水平均明显低于Ⅰ～Ⅱ期患者，抑制性受体NKG2A、CD158a、CD158b表达水平均明显高于Ⅰ～Ⅱ期患者，差异均有统计学意义（t=11.205、4.725、3.002、7.162、5.287、8.112，P＜0.01）。（表2）

表2 不同病理类型及TNM分期NSCLC患者外周血NK细胞受体表达水平（%，x-± s）

2.3 血清肿瘤标志物水平的比较

NSCLC组患者血清肿瘤标志物CEA、CYFRA21-1、NSE水平均明显高于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.01）。（表3）

表3 两组研究对象血清肿瘤标志物水平的比较（ng/ml，±s）

表3 两组研究对象血清肿瘤标志物水平的比较（ng/ml，±s）

组别NSCLC组（n=122）对照组（n=46）t值CEA 37.36±3.83 1.47±0.52 63.220 CYFRA21-1 10.95±2.62 1.92±0.50 23.176 NSE 17.06±1.99 7.65±2.42 25.712 P值0.0000.0000.000

2.4 NSCLC患者外周血NK细胞受体表达与肿瘤标志物的相关性

Pearson相关性分析显示，NSCLC患者活化性受 体 NKG2D、NKp30、NKp44及抑制性受体CD158a、CD158b表达与肿瘤标志物CEA、CYFRA21-1、NSE水平均无相关性（P＞0.05）；NSCLC患者抑制性受体NKG2A表达与CEA水平呈正相关（P＜0.05），与CYFRA21-1、NSE均无相关性（P＞0.05）。（表4）

表4 NSCLC患者外周血NK细胞受体表达与肿瘤标志物的相关性

3 讨论

NSCLC是肺癌中最常见的组织类型，国内外的发病率和病死率均位居前列[9]。近年来，尽管肺癌的临床诊治方法得到了不断提高与更新，也开始出现新的化疗药物及免疫治疗药物，但患者的整体预后仍不理想，这主要是由于多数患者在确诊时已处于晚期阶段[10-11]。目前，有关NSCLC的早期诊断和治疗仍是中国乃至世界范围需要迫切解决的一个重要难题。

细胞免疫系统是体内对抗肿瘤细胞的重要武器，主要的免疫细胞包括T细胞、B细胞、NK细胞，而NK细胞又是抵抗肿瘤细胞的第一道防线[12-13]。NK细胞表面受体按功能不同分为活化性受体和抑制性受体，NK细胞的活化受活化性受体和抑制性受体表达的调控[14]，正常情况下，活化性受体的上调可激活NK细胞，从而发挥直接杀伤肿瘤的作用，而且活化的NK细胞还可以通过诱导多种细胞因子和趋化因子的释放而发挥免疫调节及杀伤靶细胞的作用[15-16]。本研究结果显示，NSCLC组患者NK细胞活化性受体NKG2D、NKp30、NKp44表达均明显低于对照组（P＜0.01），抑制性受体NKG2A、CD158a、CD158b表达均明显高于对照组（P＜0.01），且不同TNM分期的NSCLC组患者外周血NK细胞受体表达存在明显差异（P＜0.01），提示NK细胞活化性受体表达的降低和抑制性受体表达的升高可能与NSCLC的发生及疾病进展密切相关。

肿瘤标志物是一种化学类物质，对临床疾病诊断和评估患者的预后有着重要意义[17]，近年来其也获得了越来越多的关注，其中CEA、CYFRA21-1、NSE是用于辅助诊断NSCLC的常用肿瘤标志物[18-19]。本研究结果显示，NSCLC组患者血清肿瘤标志物CEA、CYFRA21-1、NSE水平均明显高于对照组（P＜0.01），这与以往的研究报道一致[20-21]。

然而，目前尚不清楚NSCLC患者外周血NK细胞表面受体与肿瘤标志物的关系。本研究通过Pearson相关性分析研究了NSCLC患者外周血NK细胞受体表达与肿瘤标志物的关系，结果发现NSCLC患者活化性受体NKG2D、NKp30、NKp44及抑制性受体CD158a、CD158b表达与肿瘤标志物CEA、CYFRA21-1、NSE水平均无相关性（P＞0.05）；NSCLC患者抑制性受体NKG2A表达与CEA 水平呈正相关（P＜0.05），与 CYFRA21-1、NSE均无相关性（P＞0.05）。提示NK细胞表面受体与肿瘤标志物有一定关系，但由于纳入的样本量有限需要在今后进行更大规模的验证，以明确二者的关系。

综上所述，NSCLC患者外周血NK细胞活化性受体表达降低，抑制性受体表达升高，其中活化性受体表达与肿瘤标志物无相关性，抑制性受体NKG2A表达与肿瘤标志物CEA呈正相关。