胃癌相关基因与免疫生物标志物关系和作用机制的研究进展

史敏慧，张慧，姜达

河北医科大学第四医院肿瘤内科，石家庄 050011

近年来，胃癌综合治疗发展迅速，尤其是在免疫治疗方面取得了重大进展。CheckMate-649是迄今为止在胃癌及食管腺癌领域开展的规模最大的Ⅲ期临床试验，旨在评估与单独化疗相比，纳武利尤单抗联合化疗一线治疗人表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）阴性、晚期或转移性胃癌、胃食管连接部癌或食管腺癌患者的疗效，结果证实，纳武利尤单抗联合化疗可显著延长患者的总生存期（overall survival，OS）和无进展生存期（progression-free survival，PFS）[1]。HER2阳性胃癌是一类特殊类型的胃癌，KEYNOTE-811研究是一项评价帕博利珠单抗联合曲妥珠单抗+化疗治疗HER2阳性转移性胃或胃食管交界处癌的Ⅲ期随机对照临床试验，结果显示，在曲妥珠单抗联合化疗的基础上加入帕博利珠单抗，患者的客观缓解率（objective response rate，ORR）提高了22.7%[2]。基于这一结果，美国食品药品管理局（FDA）批准了帕博利珠单抗用于HER2阳性晚期胃及胃食管交界处腺癌的一线治疗。

随着胃癌一线治疗领域的突破，胃癌进入免疫治疗时代。既往研究表明，具有程序性死亡受体配 体1（programmed celldeath 1ligand 1，PDCD1LG1，也称PD-L1）高表达、高肿瘤突变负荷（tumor mutation burden-high，TMB-H）、高度微卫星不稳定性（microsatellite instability-high，MSI-H）或错配修复缺陷（deficient mismatch repair，dMMR）等特征的胃癌患者对免疫治疗有较高的敏感性和应答率，上述指标可以作为预测胃癌免疫治疗疗效的生物标志物[3]。胃癌组织中部分基因的变异可能与以上指标有关，可能是预测免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitor，ICI）治疗疗效的潜在因素，胃癌细胞中各基因与部分生物标志物的关系见表1。

表1 胃癌各基因与部分经典免疫生物标志物的关系

1 AT丰富结合域 1 A基因（AT-rich interaction domain 1 A，ARID 1 A）

ARID1A为抑癌基因，定位于染色体1p35.3，是染色质重塑复合体SWI/SNF的重要亚基。ARID1A基因可以通过促进DNA损伤和错配修复来维持基因组的稳定性。此外，ARID1A功能缺失还会引起端粒内聚亚基基质抗原1（stromal antigen 1，STAG1）的表达下调，导致细胞有丝分裂期间端粒的缺陷及染色体畸变[4]。

1.1 ARID 1 A突变/缺失与PD-L 1高表达的关系

ARID1A缺失可以通过激活磷脂酰肌醇-3-羟激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又称AKT）通路上调PD-L1的表达。有研究选取159例胃癌患者手术的组织切片，应用聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）对5个准单型单核苷酸（NR24、NR21、BAT25、BAT26、MONO27）进行重复标记，其中＜2个等位基因变异被认为是微卫星稳定（microsatellite stability，MSS），≥2个等位基因变异判定为MSI-H[5]。该研究结果发现，对MSS肿瘤来说，PD-L1阳性与ARID1A表达缺失相关（P=0.040）。在MSI-H肿瘤中，76.5%（13/17）的ARID1A缺失患者PD-L1表达阳性，而27.6%（8/29）的ARID1A保留患者PD-L1表达阳性[5]。癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）分析发现，ARID1A突变胃癌患者（n=265）中PD-L1mRNA相对表达量明显升高（P＜0.01）[5]。

1.2 ARID 1 A突变/缺失与MSI-H/dMMR的关系

ARID1A可以与错配修复（mismatch repair，MMR）系统的 MutS同系物 2（MutS homolog 2，MSH2）相互作用，在DNA复制时召集MSH2发挥MMR功能，因此，ARID1A基因突变或蛋白表达缺失均与胃癌dMMR相关。一项研究采用免疫组化法检测417例胃癌患者胃癌组织中ARID1A及MMR蛋白的表达情况，并评估MSI状态，结果发现，21.1%（88/417）的胃癌患者胃癌组织中存在ARID1A蛋白表达缺失，且ARID1A蛋白缺失与MMR蛋白缺失及MSI-H均明显相关（P＜0.05）[6]。

1.3 ARID 1 A突变/缺失与TMB-H的关系

ARID1A可以与DNA损伤检查点激酶共济失调毛细血管扩张突变基因Rad3相关蛋白（ataxia telangiectasia and Rad3 related，ATR）相互作用而被招募到DNA双链断裂处，促进DNA双链断裂转变为单链末端，维持DNA损伤应答信号。因此，ARID1A突变或表达缺失时，DNA损伤修复能力下降、基因组稳定性下降、肿瘤的TMB升高。一项国内研究回顾了2504例接受根治性胃切除术的胃腺癌患者的病历资料发现，高TMB的胃癌患者中，ARID1A基因突变率高达74.42%[7]。ARID1A突变与TMB-H的相关性在其他恶性肿瘤中也被证实[8-9]。

由此可见，ARID1A突变导致其蛋白表达缺失、功能丧失，从而影响PD-L1水平，但该关系并不稳定，可能与ARID1A的突变类型、突变丰度及其他通路的基因有关。ARID1A基因变异与dMMR/MSI-H呈正相关，且在基因和蛋白双水平上均一致。此外，ARID1A的变异与TMB-H关系密切，这与其作用机制密切相关。

2 趋化素样因子超家族成员 6（chemokine-like factor super family 6，CMTM 6）

CMTM6基因位于3号染色体p22区，其表达缺失会降低肿瘤特异性T细胞的活性并引起肿瘤免疫逃逸；此外，CMTM6还可能直接影响肿瘤细胞的增殖，也可能通过调节肿瘤微环境来促进肿瘤进展。研究显示，胃癌组织中CMTM6的表达与PD-L1的表达呈正相关（r=0.260，P＜0.01）[10]。CMTM6具有调节跨膜转运和蛋白分泌的能力，CMTM6蛋白与PD-L1特异性结合可使PD-L1/CMTM6蛋白复合体在内含体中再循环，从而保护PD-L1不被溶酶体识别并降解，以维持PD-L1的高表达。在用35S-半胱氨酸/蛋氨酸进行脉冲标记的CMTM6敲除细胞中发现，CMTM6缺失会导致PD-L1蛋白迅速降解并抑制其表达[11]。此外，CMTM6与E3泛素连接酶STUB1可能存在某种调节机制，在肿瘤细胞中抑制PD-L1的泛素化修饰，抑制其降解。CMTM6基因通过间接途径影响PD-L1的表达，其可能对ICI的靶点及治疗疗效产生影响。

3 结肠癌转移相关基因 1（metastasis associated in colon cancer 1，MACC 1）

MACC1基因位于第7号染色体7p21.1上，是肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）/肝细胞生长因子受体c-met信号转导通路中的关键调节因子。MACC1可与c-met启动子区SP1结合位点结合，启动c-met的转录，提高HGF/c-met信号通路的活性，参与调控肿瘤细胞的生长和转移。此外，MACC1可通过上调细胞外血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）C/D的分泌促进胃癌淋巴血管生成。一项胃癌的荟萃分析显示，MACC1过表达与远处转移（OR=4.68，95%CI：1.98～11.06，P＜0.01）和血管侵犯（OR=1.63，95%CI：1.11～2.38，P=0.014）有关[12]。与正常胃黏膜组织相比，胃癌组织中MACC1、c-met和PD-L1的表达水平更高，下调MACC1的表达可以抑制c-met和PD-L1的表达；体外实验还发现，c-met/AKT/雷帕霉素靶蛋白（mechanistictargetofrapamycin kinase，MTOR）通路抑制剂（SU11274、MK2206和雷帕霉素）可显著抑制c-met、AKT和MTOR的磷酸化，从而抑制MACC1对PD-L1表达的调节[13]。

MACC1除直接调节HGF/c-met通路而影响细胞增殖、分裂、迁移等活动外，还能间接对PI3K/AKT/MTOR通路产生影响。因此，MACC1的变异可能不止与免疫生物标志物相关，也可能与胃癌的其他治疗手段、免疫治疗疗效存在一定的关系。结直肠癌的研究中，MACC1的表达不受MMR状态的影响[14]，但由于dMMR的病例数相对较少，MACC1与dMMR之间的关系尚需进一步验证。

4 黏蛋白16（mucin 16，MUC16）

MUC16基因位于染色体19p13.2，其胞外部分经蛋白酶酶切后脱离细胞膜，进入血清或细胞外即为糖类抗原125（carbohydrate antigen 125，CA125），且MUC16的胞外段被酶切后，其胞内段仍在信号转导中发挥着重要作用。MUC16可以通过JAK2激活信号转导与转录激活因子3（signal transduction and activator of transcription 3，STAT3），增强胃癌细胞迁移侵袭能力。

4.1 MUC16突变与TMB-H相关

一项研究分析了TCGA队列的437份胃癌组织样本和亚洲队列的256份样本，结果显示，MUC16突变与更高的TMB相关，在控制了DNA聚合酶ε（DNA polymerase epsilon，POLE）突变及乳腺癌易感基因（breast cancer susceptibility gene，BRCA）1/2突变等因素后，这种关系仍然差异有统计学意义（OR=1.87，95%CI：1.49～2.36，P＜0.01）[15]。上述结论在泛癌种的相关研究中同样成立，且在大多数实体肿瘤中均存在差异（30种肿瘤中的25种）[16]，但MUC16突变与肿瘤较高的TMB间的关联机制仍不清楚。

4.2 MUC16突变可能与PD-L 1的表达有关

在泛癌种的研究中发现，MUC16突变肿瘤患者的特点之一为多种免疫抑制分子的表达增强，如PD-L1、程序性死亡受体1（programmed cell death 1，PDCD1，也称PD-1）、细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4（cytotoxic T lymphocyte associated antigen 4，CTLA4）、淋巴细胞活化基因3（lymphocyte activation gene 3，LAG3）等[16]，但此研究并未对各个肿瘤进行具体分析。另一项针对黑色素瘤的研究同样得出了相同结论[17]。提示MUC16突变可能与PD-L1、PD-1、CTLA4等的表达相关，但需要在未来进一步研究，提示MUC16突变的肿瘤患者对抗PD-1/PD-L1治疗存在潜在的适应性免疫抵抗，对临床治疗有一定的指导意义。

由此可见，MUC16突变肿瘤患者的肿瘤组织中CD8+T细胞和M1巨噬细胞显著高富集，且患者体内γ干扰素和T细胞炎症信号的富集程度也较高，这些免疫特征与ICI的治疗获益相关[16-17]。进一步对接受抗PD-1/PD-L1治疗的非小细胞肺癌患者和抗CTLA4治疗的黑色素瘤患者的队列分析发现，MUC16突变与患者的总生存期改善和免疫治疗高应答率相关[16]。这为MUC16突变胃癌患者的免疫治疗可能获益提供了有力证据。

5 HER 2基因

HER2基因是酪氨酸激酶受体家族成员，由位于17q染色体上的erbB-2原癌基因编码，能够抗细胞凋亡并促进细胞增殖。此外，HER2基因还可上调VEGF或血管通透因子的表达从而促进肿瘤新生血管生成，促进肿瘤细胞的侵袭和转移。

既往研究对HER2与PD-L1表达关系的研究结果并不一致。Oki等[18]的研究结果显示，免疫组化法检测HER2（+++）的胃癌患者中，72.4%（14/19）的患者胃癌组织中存在PD-L1过表达，且通过siRNA干扰HER2蛋白的表达可下调胃癌细胞PD-L1的表达。Suh等[19]的研究也发现，与HER2阴性表达的胃癌患者相比，HER2阳性表达（+++）患者胃癌组织中PD-L1的过表达更多见（PD-L1≥10%，免疫组化结果计为阳性）。还有研究表明，阻断HER2信号转导通路中PI3K/AKT/MTOR通路，可抑制HER2基因扩增胃癌细胞PD-L1的表达。但有些研究则显示了与前述研究相反的结论[20-21]。表明免疫治疗对HER2阴性胃癌患者可能更有效，而HER2阳性患者免疫治疗联合抗HER2治疗可能有效。有研究证明了PD-1单抗联合抗HER2治疗胃癌存在协同作用，曲妥珠单抗可以刺激HER2特异性的T细胞反应，促进肿瘤细胞PD-L1的表达，而PD-1单抗可以增强曲妥珠单抗的T细胞特异性免疫反应[22]。还有研究发现，抗HER2治疗后，可以下调CC趋化因子配体（CC chemokine ligand，CCL）2、CCL21、VEGF和CXC趋化因子配体1（CX-C chemokine ligand 1，CXCL1）等细胞因子的释放，改善肿瘤微环境的免疫抑制性因素[23]，从而间接与PD-1单抗发挥协同效应。KEYNOTE-811研究结果则肯定了免疫治疗在局部晚期不可切除或转移性HER2阳性胃癌或胃食管结合部腺癌患者一线治疗中的作用[24]。

KEYNOTE-811研究纳入的患者中近90%存在PD-L1联合阳性分数（combined positive score，CPS）≥1，且HER2阳性以免疫组化（+++）为主[2]，故考虑HER2与PD-L1的表达可能存在一致性。但相关研究未应用荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization，FISH）检测，亦未考察所有患者的HER2基因扩增、突变情况，仍需进一步研究PD-L1与HER2间的相关性。一项对HER2蛋白阳性转移性乳腺癌患者的研究表明，乳腺癌中HER2蛋白表达阳性会带来更高的TMB[25]，但胃癌中尚未见此种报道。

6 鼠类肉瘤病毒癌基因（kirsten rat sarcoma viral oncogene，KRAS）

KRAS基因是RAS家族的成员，位于12号染色体，与肿瘤血管生成、增殖、迁移均有关。KRAS基因容易发生突变，使细胞增殖失控、细胞内信号转导紊乱，导致细胞癌变。

6.1 KRAS突变可能与PD-L 1高表达有关

在胶质瘤或肺癌中，磷酸酶张力蛋白同源物（phosphatase and tensin homolog，PTEN）缺失、表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）或KRAS突变均可能上调PD-L1的表达。一项研究对30个PD-L1阳性胃癌样本进行KRAS突变检测，将肿瘤细胞PD-L1膜染色超过5%被判定为阳性，并确定表达强度（1+、2+、3+）和相应比例（0%～100%），H评分=1×（细胞染色1+的百分数）+2×（细胞染色2+的百分数）+3×（细胞染色3+的百分数），结果发现，3例患者呈高PD-L1表达（H评分≥150）的MSI-H患者均存在KRAS突变并伴有ARID1A缺失；另外2例KRAS突变患者均保留了ARID1A表达，PD-L1表达相对较低（H评分＜50）[5]。表明KRAS突变和ARID1A缺失可能在促进肿瘤PD-L1表达上有协同效应。

6.2 KRAS突变与MSI-H的关系

研究显示，胃癌患者中KRAS突变与MSI状态密切相关[26-27]。一项研究分析了595例术前未接受治疗的胃癌患者术后的肿瘤组织标本发现，24例患者存在KRAS突变，其中18例为MSI-H；且KRAS突变MSI-H患者的年龄较大、多为女性，中位生存期优于KRAS野生型患者（108个月vs85个月），但KRAS突变伴MSS患者的预后较差（P＜0.01）[27]。

由此可见，KRAS基因突变可能会激活促分裂原活化的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路，在对恶性黑色素瘤及非小细胞肺癌的研究中发现，MAPK通路激活可上调PD-L1的表达，化疗药物也会对此过程造成干扰[28]，但该研究缺乏对RAS基因变异的描述。因此，若想明确KRAS或RAS基因对PD-L1表达的影响，还应考察该基因的变异类型及患者的既往用药史。一项对肺腺癌的研究发现，与KRAS野生型相比，KRAS突变患者的TMB更高[29]。但对肠癌的研究结果则相反，TMB-H的肿瘤患者比低肿瘤突变负荷（tumor mutation burden-low，TMB-L）患者表现出更低的KRAS突变率[30]，且影响KRAS突变的因素有很多，不能单纯推断与TMB有关，尚需进一步探索。KRAS与MSI虽然存在一定的关系，但对预后的影响却相反，其原因可能与其他基因、通路变异有关。

7 磷脂酰肌醇- 4， 5二磷酸 3-激酶催化亚单位 α（phosphatidylinositol- 4, 5-bisphos-phate 3-kinase catalyticsubunit α，PIK 3CA）

PIK3CA是PI3K/AKT/MTOR通路重要的调节因子。根据TCGA的研究结果显示，EB病毒阳性胃癌患者的PIK3CA突变率较高（约80%），且PIK3CA突变可能先于EB病毒感染，机体感染后通过病毒潜伏膜蛋白2A（1atent membrane protein 2A，LMP2A）强化事先突变的PIK3CA功能以激活PI3K/AKT通路，从而促进胃癌细胞增殖[31]。在EB病毒阳性和MSI-H的胃癌患者中，PIK3CA的突变率较高，这些特殊的胃癌亚型可能获得更好的免疫治疗疗效[32]。研究发现，PIK3CA、TP53突变与PD-1、PD-L1和PD-L2的表达有关（P＜0.01），考虑PIK3CA突变可以改变所有PD基因的表达[33]。PIK3CA基因突变与MSI及PD-L1的关系受到PI3K/AKT/MTOR通路作用的影响，但因为影响该通路的因素较多，其具体的作用机制尚不能完全明确。此外，PIK3CA基因扩增可能与CD8+肿瘤浸润淋巴细胞（tumor infiltrating lymphocytes，TIL）密度明显降低有关，从而对PD-L1的表达产生影响，但对TMB的影响不大[34]。而有关TP53对胃癌免疫治疗疗效的影响及作用机制尚不能明确。

8 小结与展望

上述与免疫生物标志物PD-L1、TMB、MSI/MMR有关的胃癌基因中，大部分研究所观察的指标为该基因的蛋白表达水平，缺乏明确的基因变异与免疫生物标志物的相关性研究证据。同时，以上结论多来自临床前研究，尚需大规模临床研究结果的证明及支持才能将其应用于临床。此外，本文仅综述了该基因与免疫标志物间的关系，没有充分的证据表明其与免疫治疗疗效存在直接的关系，且真实世界及部分临床研究显示PD-L1、TMB、MSI/MMR也不能全面地预测ICI的治疗疗效，影响因素很多。因此，寻求精准预测指标，筛选优势人群仍是今后免疫治疗的重点。