网络药理学与分子对接分析槲皮素治疗肝癌的分子机制△

秦中强，谈燚，张兰，谭玉林#

蚌埠医学院第一附属医院1介入科，2肝胆外科，安徽 蚌埠 233000

肝癌发病率居全球第六位，病死率居第四位，每年新发肝癌约84.1万例，病死约78.2万例[1]，给社会和家庭带来了巨大负担。手术切除仍是早期肝癌患者的首选治疗方案，但由于各种原因，肝癌切除术后患者的5年复发率高达70%[2]。目前，尚没有明确的辅助疗法可供患者预防或减少术后转移和新发肿瘤风险，肝癌切除术后患者的预后仍不理想。此外，肝癌患者在接受手术切除后，应激反应和相关免疫抑制机制被激活，可能导致肿瘤细胞转移[3]。因此，寻找新的药物延缓肝癌的发生发展、减少术后转移风险是临床研究的重点。

多酚类黄酮被广泛认为是天然的、无毒的化学预防剂，这些多酚类物质多具有显著的抗氧化、抗炎和抗肿瘤特性。槲皮素作为这些多酚类黄酮的主要代表，存在于水果、饮料和蔬菜中[4-5]，表现出卓越的抗氧化和抗肿瘤潜力[6]，从而吸引了相关研究者的注意。研究显示，槲皮素在抑制肝癌细胞的氧化应激、转移和促进凋亡等过程中发挥了一定的作用[7-8]。因此，肝癌治疗过程中，槲皮素通过哪些具体的通路抑制肿瘤的发生发展值得进一步研究。目前，在药物和疾病间具体通路机制的研究中，网络药理学作为一种新型的研究方法发挥了重要的作用。本研究基于网络药理学与分子对接技术，探讨槲皮素治疗肝癌的核心基因和具体的分子机制，以期为基础研究、临床药物研发提供新思路，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 槲皮素靶点的获取

通过中药系统药理学分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology，TCMSP）（http://tcmspw.com/）和 PharmMapper数据库（http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/），以“quercetin”为关键词检索槲皮素的作用靶点，靶点种类设定为human protein，其他默认[9-10]。检索日期截至2021年6月1日。

1.2 肝癌相关靶点的获取

通过CTD数据库（http://ctdbase.org）和Gene-Cards数据库（https://www.genecards.org/），以“liver cancer”为关键词检索相关基因[11-12]。将检索到的肝癌相关靶点合并，剔除重复项，获得肝癌相关靶点。

1.3 槲皮素与肝癌交集靶点蛋白质互作（proteinprotein interaction，PPI）网络的构建

将通过筛选的相关靶点上传至在线韦恩图（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/），得到槲皮素与肝癌的交集基因，并将其导入String数据库（https://string-db.org/cgi/input.pl）[13]，构建蛋白质之间的PPI网络。交集基因导入Pather数据库得到交集靶点功能分类，将PPI网络导入Cytoscape3.7.2软件（http://www.cytoscape.org/）进行调整，并利用CytoHubba插件得到关键靶点。

1.4 GO、KEGG分析和槲皮素-主要通路-肝癌网络构建

为进一步了解交集基因的功能及其在信号通路中作用，使用R语言包对交集基因进行基因本位（gene ontology，GO）分析和京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）分析，同时构建槲皮素-主要通路-肝癌核心靶点网络。

1.5 槲皮素与肝癌分子对接

将已知的肝癌关键靶点与槲皮素进行分子对接，得到对接亲和力以反映其稳定性。通过蛋白质结构数据库（Protein Data Bank，PDB）下载肝癌的核心蛋白分子结构，PubChem数据库下载槲皮素的结构，将蛋白和槲皮素结构导入PyMol 2.4.0和Auto Dock Tools软件处理后，进行分子对接，采用PyMol 2.4.0软件进行可视化分析[14-15]。

2 结果

2.1 槲皮素潜在靶点信息

通过TCMSP、PharmMapper数据库最终得到槲皮素的潜在靶点共380个，将靶点名称上传至UniProt数据库并校正靶点名称，剔除得分较低的靶点，最终得到361个靶点。

2.2 肝癌相关靶点信息

通过CTD、GeneCards数据库共筛选出50 459个基因，其中CTD数据库33 725个，GeneCards数据库16 734个，通过筛查剔除CTD和GeneCards中关联得分较小的基因，分别筛选出631、524个关联得分较高的基因，将其合并剔除重复基因，得到995个高分靶点。

2.3 槲皮素-肝癌的交集靶点信息

将槲皮素潜在靶点信息与肝癌高分靶点取交集，得到槲皮素中与肝癌相关的127个作用靶点基因，包括TP53、caspase 8、表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）、转甲状腺素（transthyretin，TTR）、促分裂原活化的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）等。通过Panther数据库将槲皮素治疗肝癌的127个相关靶点分为7类，主要功能包括催化活性（38.5%）、结合（36.2%）、分子功能调节（17.8%）等。

2.4 槲皮素治疗肝癌相关靶点的PPI网络

将交集靶点导入String数据库，得到PPI网络，将其导入Cytoscape进行可视化分析，网络中共127个节点，2512条边，利用CytoHubba插件得到排名前10的肝癌治疗相关核心靶点分别为TP53、蛋白激酶 1（threonine kinase 1，AKT1）、myc、caspase 3、血管内皮生长因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、AP-1转录因子亚单位（AP-1 transcription factor subunit，JUN）、白细胞介素（interleukin，IL）-6、MAPK8、EGFR和MAPK1。（图1）

图1 槲皮素治疗肝癌相关靶点的PPI网络

2.5 GO功能分析结果

槲皮素治疗肝癌的GO功能结果显示，生物过程主要集中在腺体发育、凋亡信号通路调控和脂多糖应答等；细胞组成主要集中在膜筏、膜微区和膜区等；分子功能主要集中在DNA-转录因子结合、RNA聚合酶Ⅱ-特异性DNA转录因子结合、泛素样蛋白连接酶结合等。（图2）

图2 GO功能分析结果

2.6 KEGG通路富集分析结果

KEGG通路富集筛选结果共173个富集项，其中前30个最具有显著性的通路见图3，其中脂质和动脉粥样硬化、磷脂酰肌醇-3-羟激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K）/蛋白激酶 B（protein kinase B，PKB，又称AKT）信号通路、乙型肝炎、肿瘤中的蛋白多糖和MAPK信号通路等均可能为重要的通路。

图3 KEGG通路富集分析结果

2.7 分子对接分析

将槲皮素与肝癌关键靶点进行分子对接，平均对接亲和力为-6.58 kcal/mol，对接亲和力绝对值越大结合越稳定，表明槲皮素与肝癌核心靶点有较强的结合力。（表1）

表1 槲皮素与肝癌治疗相关靶点的对接结果

3 讨论

肝癌以脏腑气血亏虚为本，气、血、湿、热、瘀、毒互结为标，蕴结于肝，渐成症积，肝失疏泄为基本病机。Hisaka等[16]研究发现，槲皮素具有抑制肝癌细胞增殖的作用。已有研究表明，槲皮素可通过阻断caspase/Cyto-c通路和阻断AKT/细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）1/2信号通路的表达，抑制肝癌细胞增殖并促进其凋亡[17]。

本研究结果显示，槲皮素可能通过127个靶点治疗肝癌，通过Panther数据库分析后发现交集靶点主功能主要集中于催化活性、结合和分子功能调节。经过PPI网络分析发现，治疗的关键靶点为TP53、AKT1、myc、caspase 3和VEGFA等，其中TP53可根据生理环境和细胞类型诱导细胞生长停滞或凋亡。Mao等[18]研究发现，薯蓣皂苷通过调节p53基因引导细胞凋亡、自噬和DNA损伤，对体外和体内的肝癌表现出强大的作用。AKT1是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶中的一种，主要参与细胞代谢、增殖和凋亡等过程。异常的AKT1在糖尿病、心血管疾病和各种肿瘤中有激活作用[19]。myc可抑制前列腺素E2受体的表达，进一步阻断EP4R/c-myc通路的表达，从而抑制肝癌细胞的增殖和迁移[20]。caspase 3主要在凋亡早期及凋亡晚期中发挥作用，国内研究发现，靶向药物联合caspase 3可进一步抑制肝癌细胞增殖并促进其凋亡[21]。VEGFA具有促进增殖、迁移并抑制细胞凋亡的作用，抑制VEGFA的表达进一步减少肝癌细胞的侵袭、增殖和迁移[22]。本研究通过分子对接发现，槲皮素与上述肝癌治疗关键靶点具有良好的结合力。

KEGG富集分析发现，槲皮素治疗肝癌主要通路集中于脂质和动脉粥样硬化、PI3K/AKT信号通路、乙型肝炎、肿瘤中的蛋白多糖和MAPK信号通路等。研究发现，miRNA-1271-5p通过靶向蛋白抑制肝癌细胞增殖、迁移和侵袭过程，诱导肿瘤细胞凋亡，体外减轻乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染，并在体内抑制肿瘤生长[22]。Rahmani等[23]研究发现，肝癌患者中PI3K/AKT通路的激活与肝癌细胞的生长有关。汪丹丹等[24]发现，通过药物激活肝癌细胞中的PI3K/AKT通路，可抑制肝癌细胞的凋亡、迁移和增殖等过程。MAPK信号通路的主要作用为调节细胞生长、分化和凋亡[25]。肝癌发生发展过程中，MAPK通路主要参与细胞增殖、迁移与凋亡。通过miRNA-127转染肝癌细胞可阻断MAPK通路的表达，明显抑制肝癌细胞的体内体外增殖、迁移并促进其凋亡。槲皮素参与治疗肿瘤的重要通路包括蛋白多糖、MAPK信号通路和PI3K/AKT信号通路。GO分析中，生物过程主要集中在腺体发育、凋亡信号通路的调控、对脂多糖应答等，与上述通路介导的生物学过程相符合。

综上所述，槲皮素治疗肝癌的核心靶点为TP53、AKT1、myc、caspase 3、VEGFA等。GO 分析生物过程主要集中于腺体发育、凋亡信号通路的调控等；KEGG分析主要治疗通路集中于脂质和动脉粥样硬化、PI3K/AKT信号通路、乙型肝炎、肿瘤中的蛋白多糖和MAPK信号通路。分子对接提示，槲皮素与肝癌治疗核心靶点均有较好的结合能。以期为临床上治疗肝癌以及基础研究提供了新的治疗药物和研究方向。