可溶性B7-H4蛋白、溴结构域蛋白4、S100钙结合蛋白A4在非小细胞肺癌中的表达及与患者预后的关系

张石丰，陈艳乐，余耀华，楚玉洁

郑州大学附属郑州中心医院呼吸与危重症医学科，郑州 450000

肺癌是常见的恶性肿瘤之一，根据组织类型分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC），其中，NSCLC占所有肺癌类型的80%以上。早期NSCLC患者可无明显症状，与肺部感染等疾病的症状相似，容易被误诊从而延误治疗时机[1]。NSCLC的转移以直接扩散、血行转移、淋巴结转移为主，一旦发生转移，临床治疗难度将明显增高，生存率明显降低[2]。随着细胞与生物分子学研究的发展，NSCLC发生及转移的分子机制与肿瘤治疗的新靶点逐渐被关注。可溶性B7-H4蛋白（soluble B7-H4 protein，sB7-H4）是 B7家族新成员，在卵巢癌、乳腺癌等肿瘤中表达明显上调，具有减弱肿瘤免疫应答作用[3]。溴结构域蛋白4（bromodomain-containing protein 4，BRD4）是布罗莫结构蛋白BET家族成员，与多种恶性肿瘤患者的预后密切相关，其与NSCLC的关系一直是临床研究的热点[4]。此外，S100钙结合蛋白A4（S100 calcium binding protein A4，S100A4）与多种细胞内活动有关，与肿瘤关系的研究也越来越多[5]。本研究探讨sB7-H4、BRD4及S100A4蛋白在NSCLC中的表达及与患者预后的关系，旨在为临床NSCLC的治疗提供参考，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2016年2月至2018年8月郑州市中心医院收治的NSCLC患者。纳入标准：①经病理学检查确诊为NSCLC；②临床资料完整且真实；③接受的治疗方案相同。排除标准：①合并血液系统疾病；②合并严重精神疾病或痴呆；③合并其他原发性恶性肿瘤。依据纳入和排除标准，本研究共纳入98例NSCLC患者，其中男52例，女46例；年龄25～70岁，平均（56.71±8.82）岁。同期选取50例肺良性病变患者，其中男26例，女24例；年龄25～72岁，平均（56.75±8.79）岁。两组患者性别、年龄比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。本研究经医院伦理委员会批准通过，所有患者均知情同意并签署知情同意书。

1.2 免疫组化法检测sB 7-H 4、BRD 4及 S100 A 4蛋白的表达情况

取98例NSCLC患者的肿瘤组织及50例肺良性病变患者的正常肺组织，石蜡包埋，2 μm切片，烘烤60℃，二甲苯脱蜡，浸泡3次。抗原修复切片在离子水中浸泡3次，磷酸盐缓冲液（phosphate buffered solution，PBS）冲洗3次。滴加内源性过氧化物酶阻断剂，室温孵育15 min，冲洗。观察组滴加一抗（G-蛋白偶联受体124多克隆抗体，稀释浓度为1∶100），室温孵育1 h，冲洗；滴加辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠或羊抗兔免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）聚合物，室温孵育30 min。对照组以PBS代替一抗；滴加山羊抗兔二抗（eBioscience）室温孵育30 min。二氨基联苯胺显色，苏木素复染，梯度酒精脱水，树胶封片。

根据阳性细胞所占比例及染色强度进行结果判定[6]：无阳性细胞计0分，阳性细胞所占比例＜25%计1分，阳性细胞所占比例为26%～50%计2分，阳性细胞所占比例＞50%计3分；无着色计0分，黄色染色计1分（弱阳性），浅棕色染色计2分（中等阳性），棕褐色染色计3分（强阳性）。将阳性细胞所占比例及染色强度评分相加，0～3分为无表达或低表达，4～6分为高表达。

1.3 随访方法

所有患者治疗结束后采用门诊复查或微信、电话方法进行为期2年的随访，随访时间截至2020年8月30日，记录两组患者的预后情况。

1.4 统计学方法

采用SPSS 22.0软件对所有数据进行统计分析，计数资料以例数和率（%）表示，组间比较采用χ2检验；计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验；NSCLC患者预后的影响因素采用多因素Logistic回归分析；绘制受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线，计算曲线下面积（area under the curve，AUC），评估sB7-H4、BRD4、S100A4单独及联合检测对NSCLC患者预后的预测价值；以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 sB 7-H 4、BRD 4及 S100 A 4蛋白表达情况的比较

肿瘤组织中sB7-H4、BRD4及S100A4蛋白高表达率均明显高于正常肺组织，差异均有统计学意义（P＜0.01）。（表1）

表1 肺癌组织与正常肺组织中sB 7-H 4、BRD 4及 S100 A 4蛋白表达情况的比较

2.2 不同预后情况NSCLC患者肿瘤组织中sB 7-H 4、BRD 4及 S100 A 4蛋白表达情况的比较

随访2年，98例NSCLC患者生存73例，死亡25例。死亡NSCLC患者肿瘤组织中sB7-H4、BRD4及S100A4蛋白高表达率均高于生存患者，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（表2）

表2 不同预后情况NSCLC患者肿瘤组织中sB 7-H 4、BRD 4及 S100 A 4蛋白表达情况的比较

2.3 NSCLC患者预后生存影响因素的单因素和多因素分析

单因素分析结果显示，NSCLC患者的生存可能与病理类型、远处转移情况、分化程度、肿瘤直径、TNM分期、sB7-H4蛋白表达情况、BRD4蛋白表达情况、S100A4蛋白表达情况有关（P＜0.05），与年龄可能无关（P＞0.05）。多因素Logistic回归分析结果显示，有远处转移、分化程度为低中分化、TNM分期为Ⅲ+Ⅳ期、sB7-H4蛋白高表达、BRD4蛋白高表达、S100A4蛋白高表达均是NSCLC患者预后生存的独立危险因素（P＜0.01）。（表3）

表3 NSCLC患者预后生存影响因素的单因素和多因素分析

2.4 sB 7-H 4、BRD 4及 S100 A 4单独及联合检测对NSCLC患者死亡的预测价值

ROC曲线显示，sB7-H4+BRD4+S100A4联合检测预测NSCLC患者死亡的AUC为0.890（95%CI：0.751～1.000），高于三者单独检测的0.809、0.850、0.764。（表4、图1）

表4 sB 7-H 4、BRD 4及 S100 A 4单独及联合检测对NSCLC患者死亡的预测价值

图1 sB 7-H 4、BRD 4及 S100 A 4单独及联合检测预测NSCLC患者预后死亡的ROC曲线

3 讨论

肺癌是发病率最高的恶性肿瘤，也是全球范围内最常见的肿瘤相关死亡原因，中国每年新发肺癌约75万例[7]。超过80%的肺癌类型为NSCLC，其中30%为鳞状细胞癌，约50%的患者确诊时就已经处于晚期[8]。免疫治疗是近年来肺癌治疗领域的新突破，使NSCLC的治疗方法明显进步，但部分患者的治疗效果仍不理想，预后较差。因此，早诊断、有效治疗对NSCLC患者的预后至关重要。研究发现，NSCLC的发生发展是多种基因、细胞因子共同作用的结果，因此，开发NSCLC早期诊断的标志物及分子治疗新靶点成为临床治疗的新方向[9]。

sB7-H4属于免疫球蛋白超家族成员，其通过抑制CD4+T细胞的表达，促进细胞周期，刺激白细胞介素-2（interleukin-2，IL-2）、γ干扰素（interferon-γ，IFN-γ）对T细胞发挥负性调节作用，产生免疫应答，参与多种肿瘤的发生发展过程[10]。目前，sB7-H4已经被证明具有抗肿瘤作用，但主要集中于sB7-H4作为肿瘤抑制基因抑制卵巢癌进展方面，关于其对NSCLC的研究报道甚少[11]。本研究结果显示，sB7-H4在NSCLC患者中高表达，且其高表达是NSCLC患者预后生存的独立危险因素，提示sB7-H4蛋白对NSCLC患者的预后有重要的预测价值。

BRD4由4个α螺旋及2个螺旋茎环构成，属于布罗莫结构蛋白BET家族成员。BRD4通过布罗莫结构域与核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）的RelA亚基结合，共同刺激NF-κB的转录激活，对感染的免疫反应有重要作用[12]。既往文献认为，BRD4高表达可抑制机体的免疫反应、促进肿瘤细胞生长、侵犯脉管形成癌栓，从而导致肿瘤细胞转移，使疾病进展更快[13]。本研究结果显示，观察组患者的BRD4蛋白高表达率明显高于对照组（P＜0.01），且BRD4高表达患者的预后更差，与既往报道结果相一致。表明BRD4表达与NSCLC患者的预后密切相关，可作为评估患者预后的有效指标及新的治疗靶点。同时，本研究结果显示，有远处转移、分化程度为低中分化、TNM分期为Ⅲ+Ⅳ期、sB7-H4蛋白高表达、BRD4蛋白高表达均是NSCLC患者预后生存的独立危险因素。分析其原因可能为：BRD4能够上调血管内皮生长因子的表达及微血管密度，并可启动细胞凋亡控制程序，而突变型BRD4则会减少细胞凋亡，促进肿瘤细胞的表型转化和增殖，增强肿瘤的侵袭行为，因此，BRD4高表达可能导致高TNM分期及转移[14]。

S100A4蛋白是钙结合蛋白家族成员，一方面可激活纤溶酶原，诱导血管生成；另一方面可使肿瘤细胞与成纤维细胞、平滑肌细胞、内皮细胞、炎细胞及神经细胞等细胞间质发生互换，促进肿瘤血管生成、侵袭和转移。有研究结果显示，肿瘤细胞体外培养中，检测到了S100A4的存在，其与致癌基因发挥了协同促肿瘤作用[15]。同时，S100A4蛋白在乳腺癌细胞间质中的表达高于正常乳腺组织[16]。本研究结果显示，观察组患者的S100A4蛋白高表达率明显高于对照组，且其高表达是NSCLC患者预后生存的独立危险因素，有力证明了S100A4蛋白与NSCLC患者预后的关系，可作为预后评估的有效指标。本研究ROC曲线显示，sB7-H4、BRD4及S100A4蛋白联合检测对NSCLC患者死亡的预测价值最佳，表明联合检测可作为预测患者死亡的有效手段。

综上所述，sB7-H4、BRD4及S100A4蛋白在NSCLC患者中高表达，且高表达是影响NSCLC患者预后生存的独立危险因素，三指标联合检测对患者的预后评估有重要价值。