细胞周期激酶抑制因子4基因座中反义非编码RNA 在急性髓细胞性白血病中的表达及与患者临床特征的关系

蔡莉莉，赵凯，王根杰

商丘市第一人民医院1输血科，2检验科，3血液科，河南 商丘 476100

急性髓细胞性白血病（acute myelogenous leukemia，AML）是一种起源于造血干细胞的恶性血液肿瘤，主要表现为髓系祖细胞增殖失调、浸润、凋亡受阻，导致造血功能障碍[1-2]。AML主要表现为贫血、出血、感染等症状[3]。研究认为，基因异常和表观遗传学改变是AML发病机制中的重要环节[4-6]。长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一类可调节基因表达的生物分子，参与染色体修饰、基因印记、细胞分化、细胞周期等生物学过程。不同的lncRNA通过不同机制在AML的发生发展过程发挥重要作用[7-8]。细胞周期激酶抑制因子4基因座中反义非编码RNA（antisense non-coding RNA in the inhibitors of cyclin-dependent kinase 4 locus，ANRIL）是定位于人类染色体9p21的lncRNA，其表达异常与心血管疾病、肿瘤等密切相关[9-10]。ANRIL在AML中的报道较少，本研究探讨ANRIL在AML发生发展过程中的作用，以进一步阐述AML的发生机制，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2018年6月至2021年5月商丘市第一人民医院收治的AML患者。纳入标准：①符合AML的诊断标准，均经细胞学、免疫学、遗传学及分子生物学等检查确诊；②均接受化疗，且均可耐受；③年龄≥18岁，复查时接受骨髓疗效评价。排除标准：①合并其他恶性肿瘤、肝功能严重障碍、精神疾病或自身免疫性疾病；②合并凝血功能异常，对化疗药物过敏或存在药物禁忌证。依据纳入和排除标准，本研究共纳入82例AML患者为研究对象，作为观察组，其中男54例，女28例，中位年龄33岁。所有患者均给予柔红霉素及或阿糖胞苷方案化疗，依据患者病情分为初治组（n=53）、缓解组（n=19）和复发组（n=10）。初治依据法、美、英（France-America-British，FAB）诊断标准判定；缓解指化疗后患者的骨髓原始和幼稚细胞比例＜5%；复发指化疗后患者的骨髓原始细胞比例＞20%。另选取31例非血液病健康者，作为对照组，其中男18例，女13例；中位年龄36岁。两组受试者性别、年龄比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。本研究经医院伦理委员会审批通过，所有患者均知情同意并签署知情同意书。

1.2 主要试剂和仪器

Prime Srcipt RT reagent kit逆转录试剂盒购自大连宝生物公司，Ultra SYBR Mixture购自康为世纪生物科技有限公司。CFX96荧光聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）仪、GelDoc XR System凝胶成像系统均购自美国Bio-Rad公司。

1.3 单个核细胞提取

无菌条件下抽取所有受试者骨髓5 ml，置于含有乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）的抗凝管，1500 r/min离心5 min，取上层血浆于-80℃保存，下层加入2倍体积的生理盐水混匀。另取装有淋巴细胞分离液（Ficoll液）的离心管45°倾斜，缓慢沿离心管壁将含有生理盐水的骨髓细胞加入至Ficoll液面上层，室温2000 r/min离心30 min。此时细胞分为4层，小心吸取第2层白色层的单个核细胞，并加入等体积生理盐水洗涤，1500 r/min离心5 min，重复3次，沉淀物即为单个核细胞。

1.4 实时PCR法检测ANRILmRNA 的相对表达量

按照Trizon试剂盒提取单个核细胞的RNA，检测细胞中的mRNA浓度和纯度，然后合成互补DNA（complementary DNA，cDNA），以cDNA为模板，在荧光定量PCR仪上进行检测，反应体系：无核糖核酸酶灭菌蒸馏水 9.5 μl、cDNA 1 μl、正向引物1 μl、反向引物1 μl、2×qPCR混合物12.5 μl；反应过程：95℃预变性10 min、95℃变性10 s、58℃退火30 s、72℃延伸30 s，共40个循环，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）为内参，计算ANRILmRNA的相对表达量。引物序列：ANRIL正向引物5'-TCCATTTACCTGTGCGTGGC-3'，反向引物 5'-GAAGGAAGATTCGGCCACCT-3'；GAPDH正向引物 5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反 向 引 物 5'-AACGCTTCAATTTGCGT-3'。

1.5 统计学方法

采用SPSS 24.0软件对所有数据进行统计分析，正态分布计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，多组间两两比较采用LSD-t检验；以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ANRILmRNA 相对表达量的比较

观察组、初治组、缓解组、复发组患者骨髓ANRILmRNA的相对表达量均明显高于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.01）。复发组患者骨髓ANRILmRNA相对表达量明显高于缓解组和初治组，缓解组患者骨髓ANRILmRNA的相对表达量明显低于初治组，差异均有统计学意义（P＜0.01）。（表1）

表1 AML患者和非血液病患者骨髓ANRIL mRNA相对表达量的比较（±s）

表1 AML患者和非血液病患者骨髓ANRIL mRNA相对表达量的比较（±s）

注：a与对照组比较，P＜0.01；b与初始组比较，P＜0.01；c与缓解组比较，P＜0.01

组别观察组（n=8 2）初治组（n=5 3）缓解组（n=1 9）复发组（n=1 0）对照组（n=3 1）F值P值2.9 5±0.2 8 a 2.8 5±0.3 2 a 1.5 4±0.1 1 a b 3.4 6±0.2 8 a b c 1.0 0±0.0 8 4 4 4.0 5 6 0.0 0 0 A N R I L m R N A相对表达量

2.2 不同临床特征AML患者骨髓ANRILmRNA相对表达量的比较

不同年龄、性别、白细胞计数、血红蛋白水平AML患者骨髓ANRILmRNA相对表达量比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；血小板计数＜20×109/L、疾病进展、预后未缓解或缓解后再复发AML患者骨髓ANRILmRNA相对表达量分别明显高于血小板计数≥20×109/L、疾病无进展、预后缓解患者，差异均有统计意义（P＜0.01）。（表2）

表2 不同临床特征AML患者骨髓ANRIL mRNA相对表达量的比较（n=82）

3 讨论

研究发现，RNA表达水平的变化有助于恶性肿瘤的诊断。人类基因组中仅有不超过2%的序列能够编码蛋白质，其他序列虽然不能编码蛋白质，但超过90%的序列会转录成为RNA，此类RNA被称为非编码RNA，包括lncRNA。lncRNA是一类长度超过200个核苷酸、没有明显开放阅读框、具有基因表达调节功能的生物分子。人类基因组中存在大量的lncRNA，能够通过调节肿瘤细胞增殖、迁移、转移等生物学功能影响肿瘤的发生发展过程[11]。

ANRIL主要定位于细胞核，由19个外显子及3个重要抑癌基因簇反义方向转录形成3834 bp的mRNA上，可通过以下两个途径参与肿瘤的发生发展[10,12]：①ANRIL通过招募多梳抑制复合物（polycombrepressive complex，PRC）2介导组蛋白H3赖氨酸27的甲基化，进而抑制p15的转录，促进肿瘤细胞增殖。②ANRIL与分子伴侣CBX7相互作用，招募PRC1，介导组蛋白H3赖氨酸27甲基化，进而抑制p16蛋白的表达，促进肿瘤生长。ANRIL是引起动脉粥样硬化性血管疾病的重要原因，在肺癌、胃癌、肝癌、子宫内膜癌等恶性肿瘤中均呈高表达[10]。

本研究采用实时PCR法检测82例AML患者及31例非血液病健康者骨髓中ANRILmRNA的相对表达量，结果显示，观察组、初治组、缓解组、复发组患者骨髓ANRILmRNA的相对表达量均明显高于对照组（P＜0.01），与ANRIL在其他肿瘤中的表达趋势一致[12-13]，且Tan等[14]的研究表明，ANRIL在AML患者中高表达，且高表达ANRIL患者的OS更短。表明ANRIL可促进AML的发生发展。本研究结果显示，复发组患者骨髓ANRILmRNA相对表达量明显高于缓解组和初治组，缓解组患者骨髓ANRILmRNA的相对表达量明显低于初治组。Sun等[15]的研究也表明，ANRIL在AML患者中高表达，疗效评价为完全缓解后其相对表达量降低，且可通过抑制脂联素的表达促进AML细胞存活，其作用机制可能通过调节脂联素受体1/AMP依赖的蛋白激酶[adenosine 5’-monophosphate（AMP）-activated protein kinase，AMPK]/沉默信息调节因子1（silent information regulator 1，SIRT1）糖代谢通路有关。表明化疗药物的诱导刺激可促使ANRIL的表达上调。因此，AML患者治疗过程中应加强ANRILmRNA水平测定，根据测定结果调整治疗方案，使患者的治疗更具科学性。

综上所述，ANRIL在AML患者中高表达，其表达水平能反映患者的疾病严重程度，可指导临床诊疗。