溃疡性结肠炎中巨噬细胞差异基因及功能分析

陈梦雪 王宏刚 谢 睿

江苏省淮安市第一人民医院消化内科，江苏淮安 223300

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是一种病因不明的肠道炎症性疾病，近年来发病率持续上升[1-2]。随着高通量测序技术发展，单细胞测序（single-cell sequencing，SCS）被用于UC 的发病机制研究。SCS 评价肠道组织的单个细胞异质性，能更准确地解析各类细胞参与的肠道炎症过程[3-4]。

Boland 等[5]对UC 患者的直肠黏膜组织进行SCS分析，发现巨噬细胞与UC 的发生发展密切相关[6]。本研究挖掘SCS 数据[5]，筛选UC 与非UC 患者肠道巨噬细胞的差异基因，分析参与的生物学功能和信号通路，从固有免疫细胞角度讨论UC 的发病机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料

本研究原始数据来自数据集GSE125527。选取2019 年1 月至12 月前往the VA San Diego 医疗机构就诊的7 例UC 患者和7 名健康对照者的直肠黏膜作为对照SCS 数据进行分析。UC 组纳入标准：处于疾病活动期的UC 患者。对照组纳入标准：行结肠镜筛查的非肠炎人群。排除标准：直肠型UC；合并明显肠道并发症或感染；合并恶性肿瘤；肝肾功能不全[4]。UC 组平均年龄（43.3±13.6）岁；男3 例，病程中位数为6 年；女4 例，病程中位数为9 年；病变范围为左半结肠1 例，全结肠6 例。Mayo 内镜评分为轻度1 例，中度5 例，重度1 例[7]。对照组平均年龄（48.1±17.8）岁；男5 例，女2 例。

1.2 研究方法

1.2.1 质控及筛选细胞 计算每个细胞中nFeature-RNA。过滤掉基因数目＞2500、＜200 及超过5%的线粒体占比的细胞。

1.2.2 鉴定差异基因 使用vst 方法计算细胞与细胞之间的差异基因。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

1.2.3 聚类分析 进行数据标准化，基于筛选好的主成分对细胞进行聚类。

1.2.4 基因本体论（gene ontology，GO）功能和京都基金和基因组数据库（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）信号通路富集分析 采用cluster Profiler R 包对巨噬细胞的标记基因进行功能富集和信号通路富集分析。富集分析基于超几何分布原理。

2 结果

2.1 聚类分析结果

获得了15 个聚类的细胞群，不同类的细胞群标记为不同的颜色，分别用cluster 0 至14 表示。见图1。

2.2 巨噬细胞识别

CellMarker 数据库检索到143 个人的巨噬细胞标记基因。与cluster 对应的基因进行交集，有19 个巨噬细胞的标记基因属于cluster 11，分别为CD68、CD14、CD86、LYZ、TREM1、MS4A7、MXD1、SPINT2、PLBD1、CSF1R、FGR、FAM49A、CYBB、DSE、MS4A6A、SAMHD1、CIITA、TGFBI、AIF1，所以识别cluster 11 为巨噬细胞。

2.3 差异基因筛选

将两组巨噬细胞进行基因表达量分析，共筛选出31 个显著差异基因。按照差异倍数（对照/UC）的对数值（logFC）由小到大排序，见表1。结果显示，TIMP1、IFITM3、IGHG1 在UC 组显著高表达。

表1 两组巨噬细胞差异基因

2.4 GO 功能富集分析

包括生物过程（biological process，BP）、细胞组成（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）3 个方面。在BP 方面，差异基因富集于对氧化应激、对活性氧、对病原体的防御、体液免疫等反应。在CC 方面，主要富集于分泌颗粒内腔、胞质囊腔、囊腔等。在MF 方面，主要富集于酶抑制剂活性等。见图2。

2.5 KEGG 信号通路富集分析

差异基因显著富集于白细胞介素-17（interleukin-17，IL-17）、趋化因子、Toll 样受体等信号通路。见图3。这些信号通路是巨噬细胞炎症调控的重要通路，提示巨噬细胞可能通过这些炎症信号通路参与UC。

3 讨论

UC 是多种免疫细胞参与的慢性肠道炎性疾病[8]，发病的免疫学机制逐渐被深入研究。SCS 较多应用于肿瘤研究[9]，在UC 中少有报道。Boland 等[5]对7 例UC患者的直肠黏膜组织行SCS 分析，提出适应性免疫细胞在UC 中的作用机制。但是，以巨噬细胞为代表的固有免疫细胞是否参与UC 尚未充分阐述。

巨噬细胞常驻于肠道固有层，维持肠道稳态，在病原体感染、炎症反应、免疫激活等方面起着重要作用[10-11]。UC 肠道微环境中，巨噬细胞的分化过程受到干扰，过多分泌促炎因子，加重UC 进展[12-13]。因此，应用SCS 分析UC 患者的肠道巨噬细胞功能有重要意义。

本研究比较UC 组和对照组巨噬细胞基因转录水平，筛选出31 个差异基因。其中，TIMP1、IFITM3、IGHG1 在UC 组巨噬细胞中显著高表达。本研究认为肠道巨噬细胞的这3 个基因可能与UC 密切相关。TIMP1 是基质金属蛋白酶的抑制酶，参与肿瘤、炎症等过程[14-15]。吴娜等[16]通过生物信息学分析发现，TIPM1 是活动期UC 的关键因子。IFITM3 是一种固有免疫系统反应蛋白，被认为是免疫开关，可能增加结肠癌风险[17]。IGHG1 是免疫球蛋白重链编码基因，参与肿瘤免疫过程[18-19]。因此，这3 个基因可能是参与UC 异型增生甚至癌变的相关因子。既往研究发现，广泛结肠型和年龄大是我国UC 患者发生异型增生的2 个独立危险因素[20-21]。对结肠炎症范围广和年龄较大的高危人群进行肠黏膜活检，检测这3 个基因的表达从而预测异型增生，未来可能用于临床监测UC 癌变。

氧化应激可导致促炎巨噬细胞的结肠浸润，加重结肠炎[22]。Galectin-1 通过抑制炎症和氧化应激，降低了葡聚糖硫酸钠诱导的UC 的严重程度[23]。去除氧自由基，减少氧化应激，有助于UC 恢复。另外，IL-17 可分泌Th17 细胞、巨噬细胞等，参与肠道炎症。然而，关于IL-17 信号通路在UC 中的抗炎或促炎作用尚存争议。有研究报道，活动期UC 患者的肠黏膜和血清中IL-17 的水平升高，与UC 临床严重程度呈显著相关，但抑制IL-17 并不能有效诱导UC 缓解[24]。在动物研究中，敲除IL-17 后，小鼠的结肠炎症显得更加严重[25]。可见，IL-17 在UC 中显示出高度复杂性。

综上，本研究筛选出UC 患者肠道巨噬细胞的差异基因，且巨噬细胞的氧化应激和IL-17 信号通路可能参与UC 疾病过程，这将为进一步研究UC 发病机制提供依据。