膳食纤维对大鼠脑缺血后PTEN/PI3K/Akt/NF-κB 信号通路的影响

杨事达 曲慧玲

1.辽宁省人民医院检验科，辽宁沈阳 110015；2.北部战区总医院神经内科，辽宁沈阳 110016

脑梗死可诱导病理生理级联反应，包括最初的兴奋性毒性，随后是较长的神经炎症期[1]。此外，脑梗死可以被视为一种系统性疾病，也影响远程器官功能，包括肺及免疫系统和肠道功能[2]。最近，有研究表明，肠道菌群异常与患者的预后恶化相关[3-4]，并且这些变化在住院后3 周内都很明显。啮齿类动物脑梗死模型的进一步实验研究已经确定了免疫系统在沿着肠-脑轴介导过程中起着关键作用[5-6]。肠道微生物组产生大量生物活性代谢物可能通过调节免疫系统或传入神经通路影响大脑功能，特别是短链脂肪酸（shortchain fatty acid，SCFA），其中的醋酸盐、丁酸盐和丙酸盐已被证明容易越过血脑屏障，并影响大脑在发育、健康和疾病中的功能[7-9]。例如，SCFAs 治疗通过促进抗炎机制和减少轴突损伤来改善实验性自身免疫性脑炎的病程[10]。尽管肠道微生物组对脑梗死预后有重要贡献，并且SCFAs 是微生物组的主要生物活性介质之一，但SCFAs 在脑缺血后慢性期脑梗死后恢复中的作用及其潜在治疗用途尚未得到研究。本研究探讨添加膳食纤维后对脑梗死后大鼠脑内炎症反应通路的调控。

1 材料与方法

1.1 实验动物

成年雄性Wistar 大鼠，体重200～250 g，由中国医科大学实验动物中心提供，实验动物合格证号：211002300052024，动物许可证号：SCXK[辽]2015-0001，所有动物实验操作程序符合中国医科大学伦理委员会管理条例要求。

1.2 仪器与试剂

ET-1 购于美国Sigma-Aldrich 公司，产品批号：E6877；Anti-PTEN 抗体购于美国Abcam 公司，产品批号：ab 267787；Anti-p-PI3K 抗体购于美国Abcam公司，产品批号：ab 278545；Anti-p-Akt 抗体购于美国Abcam 公司，产品批号：ab38449；Anti-PI3K 抗体购于美国Abcam 公司，产品批号：ab32089；Anti-Akt 抗体购于美国Abcam 公司，产品批号：ab 108202；Anti-NF-κB/p65 抗体购于美国Abcam 公司，产品批号：ab 207297；Anti-β-Actin 抗体购于美国Abcam 公司，产品批号：ab115777。微量注射器（型号：87943）购于美国Hamilton 公司；蛋白电泳仪（型号：PowerPac HV）购于美国Bio-Rad 公司；电转膜装置（型号：Trans-Blot®TurboTM）购于美国Bio-Rad 公司；摇床购于德国Heidolph（型号：6173000）公司。

1.3 研究方法

1.3.1 实验动物分组 随机选取24 只大鼠颅内注射内皮素（endothelin，ET-1）制作脑缺血模型，模型制作完成后4 只大鼠死亡。剩余20 只大鼠按照随机数字表法分为缺血组和缺血+膳食纤维组，每组10 只；另随机取10 只大鼠作为假手术组，大鼠颅内注射生理盐水作为对照，假手术组的大鼠均存活。

1.3.2 脑缺血模型的制作方法 将ET-1 用生理盐水稀释成0.5 μg/μl，注射点为以下3 点（根据大鼠脑解剖图谱，AP 示以前囟为中心向前，ML 示以前囟为中心向侧方，DV 示以前囟为中心向下方）[11-12]：①AP+0.7 mm、ML+2.2 mm、DV-2.0 mm；②AP+2.3 mm、ML+2.5 mm、DV-2.3 mm；③AP+0.7 mm、ML+3.8 mm、DV-5.8 mm。ET-1 用微量注射器以0.5 μl/min 注射。注射ET-1 后约3 h（此时大鼠麻醉已清醒）若大鼠出现提尾倒悬时右上肢向胸前屈曲或行走时向右侧倾倒或向右侧转圈，且症状持续超过24 h，则可判定为缺血模型制作成功[13]。

1.3.3 膳食纤维的添加 在大鼠饲养过程中，7～35 d 给予膳食纤维经口喂入，每周固定两天添加饲料，其他时间可根据大鼠进食情况随时注意添加。正常饮食组即缺血组和假手术组饲料成分配比如下：玉米淀粉为465.692 g/kg、络蛋白为140.000 g/kg、糊精玉米淀粉为155.000 g/kg、蔗糖为100.000 g/kg、大豆油为40.000 g/kg、纤维素为50.000 g/kg、矿物混合物（AIN-93M）为35.000 g/kg、维生素混合物（AIN-93）为10.000 g/kg、L-胱氨酸为1.800 g/kg、胆碱酒石酸为2.500 g/kg、丁基化羟基甲苯为0.008 g/kg。缺血+膳食纤维组饲料成分配比如下：玉米淀粉为465.692 g/kg、络蛋白为140.000 g/kg、果胶为25.000g/kg、糊精玉米淀粉为25.000g/kg、蔗糖为100.000 g/kg、大豆油为40.000 g/kg、纤维素为150.000 g/kg、矿物混合物（AIN-93M）为35.000 g/kg、维生素混合物（AIN-93）为10.000 g/kg、L-胱氨酸为1.800 g/kg、胆碱酒石酸为2.500 g/kg、丁基化羟基甲苯为0.008 g/kg。

1.3.4 梗死体积的测量 第40 天时，使用尼氏染色测量缺血组和缺血+膳食纤维组之间脑梗死的体积的差异。通过NIH Image J 软件进行测量，得到总的梗死体积。

1.3.5 Western blot 脑缺血术后40 d，把每组大鼠麻醉，提取梗死周边组织。提取蛋白，然后进行蛋白定量、按照每个孔上样10 μl，含总蛋白50 μg，上样2 μl缓冲液。充分混匀后，金属浴5 min，储存于-20℃。聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳接受后进行转膜。转膜完成后，室温封闭1 h。然后进行杂交和显色，Image J 软件分析条带灰度值。

1.4 统计学方法

采用SPSS 16.0 软件对所得数据进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t 检验。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组梗死体积比较

缺血组梗死体积为（130.853±11.462）mm3，与缺血+膳食纤维组梗死体积[（127.371±9.857）mm3]比较，差异无统计学意义（t=0.728，P=0.475）。

2.2 膳食纤维对大鼠脑缺血后PTEN/PI3K/AKT/NF-κB 信号通路蛋白表达的影响

缺血组的p-PI3K、p-Akt 的蛋白表达低于假手术组，差异有统计学意义（P ＜0.05）；缺血+膳食纤维组的p-PI3K、p-Akt 的蛋白表达高于缺血组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。缺血组的PTEN、NF-κB/p65 的蛋白表达高于假手术组，差异有统计学意义（P ＜0.05）；缺血+膳食纤维组的PTEN、NF-κB/p65 的蛋白表达低于缺血组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见图1。

3 讨论

本研究证实了肠道菌群及其代谢产物SCFAs 可以作为一种干预“靶点”，通过针对性地对他们进行调控，就有可能通过调控梗死后的炎症反应从而在脑梗死的治疗及神经功能的恢复等方面发挥作用。本课题组前期工作表明添加膳食纤维能够抑制小胶质细胞的激活，膳食纤维可以被肠道菌群代谢发酵而产生SCFAs[14]。通过对小胶质细胞功能的调节作用，可促进脑卒中后恢复[8]。SCFAs 对脑卒中后恢复和神经元可塑性的影响可能是通过小胶质细胞活动间接介导的，与树突重塑和小胶质细胞的重塑有关[15-17]。研究表明脑梗死后补充SCFAs 后细胞分支增加，提示小胶质细胞活化状态降低。因此，SCFAs 对小胶质细胞激活的修饰可能会对突触消除产生影响，从而影响小胶质细胞依赖性突触可塑性[18]。RNA Seq 分析结果表明，SCFAs 在这一过程中主要抑制小胶质细胞的激活[8]。

NF-κB 是广泛已知的与脑缺血后小胶质细胞活化的关键转录因子[19]。PI3K/Akt 信号是NF-κB 信号通路的主要上游元件。PI3K/Akt 信号通路在神经元中表达最为明显，而在神经胶质细胞内也有表达。以前的研究表明，Akt（Thr-308 和Ser-473）的磷酸化是Akt 活化的原因。Akt 是一种主要的神经保护因子。Akt 磷酸化的增加反映了Akt 活性的增加。PI3K/Akt信号转导参与了基因表达的调控。然而，PTEN 基因可以负向调控PI3K/Akt 信号通路。PTEN 在中枢神经系统发育中也起到一定的作用[20]。近年来，人们对PTEN抑制剂在脑缺血损伤中的研究表明在脑缺血后，PTEN 过度表达，并通过PI3K/Akt 途径参与缺血性卒中的发生[21-25]。此外，Toll 样受体4（Toll-like receptor 4，TLR4）是先天性免疫反应的主要组成部分，其配体脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）可以激活大鼠海马神经元的兴奋。LPS 可以激活细胞内磷酸酶活性通过蛋白的去磷酸化导致PTEN 活化，进而抑制Akt 磷酸化，TLR4 的活化通过去磷酸化激活PTEN，TLR4 的解离通过去磷酸化激活第二信使PIP3，抑制PI3K，从而抑制下游因子Akt 的活化，最终导致NF-κB 的释放，而LPS对PTEN 和Akt 磷酸化状态的影响通过阻断TLR4 激活而逆转。那么调控PTEN/PI3K/Akt/NF-κB 信号通路，则能够抑制脑缺血后小胶质细胞的激活，进而抑制脑缺血后的炎症反应。而SCFAs 发挥作用的机制其中一条是通过上调PI3K/Akt 信号，抑制NF-κB 通路的激活[26-27]。本研究结果显示SCFAs 抑制了PTEN 的表达，从而调控PI3K/Akt/NF-κB 信号通路。添加膳食纤维后，应用Western blot 方法测定梗死周围组织NF-κB 表达水平，结果发现，与缺血组比较，膳食纤维产生的SCFAs 增多，该组大鼠脑梗死周边区域PTEN 降低，p-PI3K 及p-Akt的表达明显增高，而细胞核NF-κB/p65 水平显著降低。

本研究显示脑梗死后添加膳食纤维能够抑制了PTEN 的表达，上调PI3K/Akt 信号，抑制NF-κB 通路的激活，有效抑制缺血后小胶质细胞的活化，这些研究成果为临床治疗带来新的方法。