奥佐米星对急性髓细胞性白血病的细胞毒性及其与CD33 表达水平的关系研究

王真真 李炜静

1.河北医科大学第二医院血液内科，河北石家庄 050000；2.河北医科大学第四医院血液内科，河北石家庄 050011

急性髓细胞性白血病（acute myeloid leukemia，AML）的研究在近年来飞速进展，但大多数患者仍很难通过现有的治疗方法痊愈，目前新的治疗方案正在研究之中。CD33 是一种67 kD 的1 型跨膜唾液酸糖蛋白，属于免疫应答的免疫球蛋白超家族成员。80%以上的AML 原始细胞均表达CD33[1-2]，其作为一种AML治疗靶点，其在临床上具有重要意义。奥佐米星（Gemtuzumab Ozogamicin，GO）是一种由人源化IgG4抗CD33单克隆抗体（hP67.6），与细胞毒蛋白-1 的衍生物结合而成的免疫结合物[3]，用于治疗复发型和难治型AML，其以抗CD33 抗体（hP67.6）为载体，促进癌细胞凋亡。在临床前模型中，GO 能够杀死CD33 阳性的白血病细胞[4]，因此其已被批准用于治疗65 岁以上复发性难治性AML[5]。然而GO 的细胞毒性作用与细胞表面CD33 表达量的关系及作用机制目前尚少见研究[6]。因此，本研究的主要目的是研究GO 介导的细胞毒性与CD33 表达量之间的关系及相关信号通路。

1 材料与方法

1.1 材料

选取细胞表面CD33 水平较低的人髓系OCIAML3 和KG-1a 细胞，用含有25 mmol/L N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸、10%热灭活胎牛血清、1 mmol丙酮酸钠和非必需氨基酸的培养基中进行传代培养。OCI-AML3 和KG-1a 细胞购于ATCC 细胞库，胎牛血清购于美国Gibco 公司（货号：12999145）；慢病毒（A35347，A35827）购于赛默飞公司；MTT 细胞增殖检测试剂盒购于Sigma（货号：M5672-1G）；Anti-Bcl-2（ab182858）、Anti-Caspase-3（ab202068）、Anti-Cleaved caspase-3（ab184787）购于美国Abcam 公司。

1.2 慢病毒转染

采用含有增强绿色荧光蛋白和CD33 过表达的质粒载体的慢病毒进行OCI-AML3 和KG-1a 细胞转染。细胞培养过夜，将2×105个/ml 的悬浮细胞中加入聚凝胺，配成6 μg/ml 的混合液，加入不同梯度浓度的慢病毒，充分混匀。37℃孵育，4 h 后，加入等体积新鲜培养基，继续培养3～4 d。通过流式细胞术分析增强绿色荧光蛋白表达情况来鉴别慢病毒转染效率。通过流式细胞仪分选增强绿色荧光蛋白阳性细胞，并重新培养以进行进一步分析。根据CD33 表达量将细胞分为CD33 高表达组和CD33 低表达组。

1.3 MTT 法检测细胞增殖情况

取对数生长期细胞，接种于96 孔板中，于37℃、5%CO2恒温恒湿培养箱中培养12 h 后，采用15 μg/L浓度的GO 处理细胞[7]，每组设置3 个复孔。培养48 h后，每孔加入10 μl 的5 mg/ml MTT 溶液，于培养箱中孵育4 h；除去96 孔板中的所有培养液，加入二甲基亚砜，在摇床上避光振摇过夜，检测各孔的OD 值。

1.4 凋亡相关蛋白检测

分别采用0、5、10 和15 μg/L 浓度的GO 处 理OCI-AML3 细胞，采用蛋白质印迹法检测细胞凋亡相关蛋白的表达水平。取对数生长期细胞，以2×106个/孔接种于6 孔板，于恒温恒湿培养箱中孵育；收集细胞，采用RIPA 裂解液提取细胞蛋白，电泳分离提取的蛋白；将蛋白转移至硝化纤维素膜，洗膜，脱脂奶粉封闭40 min，洗膜；加入抗体Bcl-2、caspase 3、cleaved caspase 3 和β-Actin，4℃孵育过夜；洗膜后加入抗鼠IgG，室温孵育，置于凝胶成像系统内曝光。以β-Actin为内参，采用2-ΔΔCt法计算蛋白的相对表达量。

1.5 统计学方法

采用SPSS 22.0 对所得数据进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差（）表示，比较采用t 检验；多组计量资料比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t 检验。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 慢病毒转染前后细胞表面CD33 表达水平比较

转染后，OCI-AML3 和KG-1a 细胞表面CD33 表达水平均高于转染前，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见图1。

2.2 GO 对CD33 高表达组和CD33 低表达组细胞存活率的影响

相同浓度的GO 处理后，CD33 高表达组的OCIAML3 和KG-1a 细胞存活率均低于CD33 低表达组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见表1。

表1 奥佐米星对CD33 高表达组和CD33 低表达组细胞存活率的影响（%，）

表1 奥佐米星对CD33 高表达组和CD33 低表达组细胞存活率的影响（%，）

2.3 不同浓度GO 处理OCI-AML3 细胞的凋亡相关蛋白水平比较

GO 浓 度 为5、10、15 μg/L 时，OCI-AML3 细 胞Bcl-2 水平低于GO 浓度为0 时，cleaved-caspase 3、caspase 3 水平均高于GO 浓度为0 时；GO 浓度为10、15 μg/L 时OCI-AML3 细胞Bcl-2 水平低于GO 浓度为5 μg/L 时，cleaved-caspase 3、caspase 3 水平均高于GO 浓度为5 μg/L 时；GO 浓度为15 μg/L 时，OCIAML3 细胞Bcl-2 水平低于GO 浓度为10 μg/L 时，cleaved-caspase 3、caspase 3 水平均高于GO 浓度为10 μg/L 时，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见图2。

3 讨论

复发和/或难治性AML 患者常表现为多重耐药，尽管相关研究在近年来取得了飞速进展[8-10]，但大多数患者仍不能通过现有的治疗方法痊愈。而Ⅰ/Ⅱ期临床试验表明[11-15]，对复发和/或难治性AML 患者进行特异性抗体靶向化疗可能获得包括完全缓解在内的临床效果。当将GO 作为单一药物用于复发的老年AML 患者时，中位总生存期约为6 个月，能显著改善AML 患者预后[16-19]。GO 在中国人群中的应用尚未可知，本研究就GO 与CD33 的关系及作用机制进行了分析。

研究表明，对CD33 高表达的人髓系细胞，GO 的细胞毒性更强[20-21]。GO 敏感性与细胞表面CD33 表达水平直接相关。在国外一些Ⅱ期临床试验中[12,22-24]，对CD33 表达水平高的患者GO 的临床疗效往往越好。本研究结果提示，调整AML 细胞CD33 的表达水平可能是提高临床疗效的新方法。因此，GO 在AML 的治疗中可能具有广大的应用前景[25]。

促进肿瘤细胞凋亡是抗癌药物发挥作用的一种重要的通路。本研究结果提示，GO 能诱导OCI-AML3细胞凋亡。抗凋亡蛋白及促进凋亡的蛋白家族成员在细胞凋亡中发挥着关键性作用。蛋白质免疫印迹法结果显示，GO 上调了细胞cleaved-caspase 3 和caspase 3的表达，下调Bcl-2 的表达，提示GO 可以有效地促进AML 细胞的凋亡。