环脂蛋白20 调控组蛋白H2B 泛素化经NF-κB信号通路对巨噬细胞迁移的影响

卞姝，张曼，刘岩，姜朝阳，陈红

沈阳医学院附属中心医院全科医学科，沈阳110024

摘要：目的 探讨环指蛋白20（RNF20）调控组蛋白H2B 泛素化（H2Bub）经核因子-κB（NF-κB）途径对巨噬细胞迁移的影响。方法 将培养好的巨噬细胞分为7 组，A 组（对照组）：培养48 h；B 组（ox-LDL 刺激组）：50 mg/mL ox-LDL 刺激巨噬细胞48 h；C 组（ox-LDL+oe-RNF20 转染组）：oe-RNF20 转染巨噬细胞后用50 mg/mL ox-LDL 刺激48 h；D 组（ox-LDL+pcDNA 转染对照组）：pcDNA 转染巨噬细胞后用50 mg/mL ox-LDL 刺激48 h；E 组（ox-LDL+SN50 干预组）：50 mg/mL ox-LDL 刺激巨噬细胞24 h 后再给予10 µg/mL 的SN50 处理24 h，共干 预48 h；F 组（ox-LDL+LY 294002 干预组）：50 mg/mL ox-LDL 刺激巨噬细胞24 h 后再给予10µg/mL 的LY 294002 处理24 h，共干 预48 h；G组（ox-LDL+p38干预组）：50 mg/mL ox-LDL 刺激24 h后再给予10µg/mL的p38，共干 预48 h。采用Transwell法观察巨噬细胞迁移数量，Western blotting 法检测RNF20、H2B、H2Bub、NF-κB 及白细胞介素6（IL-6）表达。结果 在ox-LDL刺激的巨噬细胞中，与A组比较，B组RNF20蛋白表达、H2Bub/H2B降低，巨噬 细胞迁移数量增多，NF-κB和IL-6 蛋白表达增加（P 均＜0.01）。在RNF20 过表达细胞模型中，与B 组比较，C 组RNF20 蛋白表达、H2Bub/H2B 增加，NF-κB、IL-6 蛋白表达减少，巨噬 细胞迁移数量减少（P 均＜0.01）；D 组RNF20 蛋白表达、H2Bub/H2B、NF-κB、IL-6 无明显改变，巨噬 细胞迁移数量无明显改变（P 均＞0.05）。给予SN50（NF-κB 抑制剂）、SB 203580（p38 抑制剂）和LY 294002（PI3K 抑制剂）处理巨噬细胞后，与B 组比较，E、F、G 组RNF20 蛋白表达、H2Bub/H2B 无明显改变（P 均＞0.05）；E组NF-κB、IL-6蛋白表达及巨噬细胞迁移数量减少（P均＜0.01）；F、G组NF-κB、IL-6蛋白表达及巨噬细胞迁移数量无明显改变（P均＞0.05）。结论 RNF20减少，H2Bub减少，加剧 巨噬细胞迁移及炎症反应，促进 了动脉粥样硬化的形成，此过 程经NF-κB信号通路起作用。

关键词：动脉粥样硬化；基因表观遗传学；组蛋白泛素化；环指蛋白20；核因子-κB；巨噬细胞迁移

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2022.10.014

中图分类号：R543.5文献标志码：A文章编号：1002-266X（2022）10-0060-04

动脉粥样硬化（AS）是慢性炎性疾病。巨噬细胞向血管内膜的迁移及炎症反应是AS 发生的重要环节［1］。基因表观遗传学是指基因的表达被调控与修改，但脱氧核糖核酸（DNA）序列却仍保持原来的状态，产生可遗传的变化［2］。组蛋白经翻译后的泛素化修饰是其重要一员，其错误的修饰将导致人体结构与功能异常，从而导致疾病发生［3］。基因表观遗传学可能是AS的最新研究热点［4］。组蛋白是染色质中的重要成分，其含有大量碱性蛋白质，与酸性DNA紧密结合［5］。组蛋白经过泛素化或去泛素化等翻译后修饰，会影响DNA 损伤修复、基因转录调控、细胞周期以及炎症反应等过程［6］。环指蛋白20（RNF20）是组蛋白H2B泛素化（H2Bub）修饰过程中的泛素化链接酶。研究表明，在肿瘤坏死因子α（TNF-α）刺激的人乳腺上皮细胞MCF10A中，RNF20参与H2Bub调控，抑制炎症相关基因激活［7］。2020年12月―2021年11月，我们通过ox-LDL 刺激构建巨噬细胞炎症迁移模型，探讨RNF20 调控组蛋白H2Bub 修饰经NF-κB 途径参与巨噬细胞迁移及炎症反应过程，为AS的预防与治疗提供思路。

1 材料与方法

1.1 材料 小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞系，购自中国丰晖生物技术有限公司；DMEM 培养基、FBS、Hyclone 购自美国Gibco 公司；ox-LDL 购自广州奕源生物科技有限公司；BCA 试剂盒购自北京索莱宝生物科技有限公司；SN50（NF-KB 抑制剂）购自上海西格生物有限公司；SB203580（P38 抑制剂）；LY294002（PI3K 抑制剂）购自上海碧云天生物技术有限公司；Transwell 小室购自美国Conring 公司；anti-RNF20 一抗、anti-IL-6 一抗、anti-H2B 一抗、anti-NF-κB 一抗、anti-β-actin 一抗、HRP 标记的羊抗兔抗体均购自美国Abclonal 公司；anti-H2Bub 一抗购自美国CST 公司；RNF20 过表达载体质粒oe-RNF20 及相应的对照质粒pcDNA 购自上海生工生物工程股份有限公司。

1.2 巨噬细胞培养 小鼠RAW264.7 巨噬细胞培养于DMEM 培养基中，培养基中含有10%FBS、1%的青链霉素，置于温度37 ℃、含有5%CO2的细胞恒温箱中培养。当细胞生长状态良好且密度达到80%左右，用PBS冲洗，胰蛋白酶消化完全后进行传代，传至6～10代的RAW264.7巨噬细胞进行后续实验。

1.3 巨噬细胞转染 当细胞培养至生长状态良好且密度达80%左右时，弃含有血清的培养基，用PBS溶液冲洗。用Opti-MEMI 分别将LipofectamineTM3000、oe-RNF20、pcDNA混合均匀后，置于37 ℃培养箱中，6 h 后当细胞转染率达到80%时，更换细胞培养基，转染结束后继续用ox-LDL刺激48 h。

1.4 细胞分组及干预 将细胞随机分为7 组，A 组（对照组）：培养48 h；B 组（ox-LDL 刺激组）：应用50 mg/mL ox-LDL 刺激48 h；C 组（ox-LDL+oe-RNF20转染组）：oe-RNF20 转入巨噬细胞后用50 mg/mL ox-LDL 刺激48 h；D 组（ox-LDL+pcDNA 转染对照组）：pcDNA 转入巨噬细胞后用50 mg/mL ox-LDL 刺激48 h；E 组（ox-LDL+SN50 干预组）：应用50 mg/mL的ox-LDL刺激24 h后再给予10µg/mL的SN50处理24 h，共干预48 h；F组（ox-LDL+LY294002干预组）：应用50 mg/mL的ox-LDL刺激24 h后再给予10µg/mL的LY294002处理24 h，共干预48 h；G组（ox-LDL+p38干预组）：应用50 mg/mL的ox-LDL刺激24 h后再给予10µg/mL的p38，共干预48 h，采样检测。

1.5 RNF20、H2B、H2Bub、NF-κB、IL-6 蛋白表达检测 采用Western blotting 法。提取不同组的细胞蛋白，使用BCA法测量不同组间的蛋白浓度。取30µg的上样量进行电泳、转膜，牛奶封闭2 h，加入用TBST 配置好的一抗，4 ℃过夜，洗膜3 次，每次8 min。然后加入用TBST 配置的二抗，在室温下摇晃40 min，再次洗膜3次，每次8 min。最后使用ECL发光液进行显色，使用Image J 进行灰度值分析与计算，测量3次后取平均值。

1.6 巨噬迁移能力检测 采用Transwell 实验。按照Transwell 说明书，将密度达到50%的巨噬细胞用胰酶消化，制成适量浓度的细胞悬液后，取适量悬液进行计数，在小室下室加含血清培养基，在小室上室加无血清的培养基并将细胞接种于小室上室。将含有细胞的小室培养48 h 后取出，用甲醛对细胞进行固定，结晶紫对细胞染色，PBS 溶液进行清洗。最后清除未穿过小室的细胞，置于显微镜观察并拍照。每组细胞分别接种于3 个小室，平均值即细胞迁移数量。

1.7 统计学方法 采用SPSS22.0统计软件。符合正态分布的计量数据以-x±s表示，多组比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用SNK-q法，两组比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同处理各组巨噬细胞蛋白表达及巨噬细胞迁移变化 见表1。

表1 各组蛋白表达及迁移细胞数比较（-x±s）

2.2 上调RNF20 对巨噬细胞炎症及迁移影响 与A 组比较，B 组RNF20 蛋白表达减少（P＜0.01），H2Bub/H2B 减小（P＜0.01），NF-κB 和IL-6 蛋白表达增加（P均＜0.01），巨噬细胞迁移数量增多（P＜0.01）；与B 组比较，C 组RNF20 蛋白表达增加（P＜0.01），H2Bub/H2B 增加（P＜0.01），NF-κB、IL-6 蛋白表达减少（P均＜0.01），巨噬细胞迁移数量减少（P＜0.01）；D组RNF20蛋白表达、H2Bub/H2B、NF-κB、IL-6 蛋白表达、巨噬细胞迁移数量与B 组比较差异均无统计学意义（P均＞0.05）。

2.3 RNF20 介导的H2Bub 经NF-κB 途径对巨噬细胞炎症及迁移影响 E、F及G 组RNF20蛋白表达与B组比较差异均无统计学意义（P均＞0.05），H2Bub/H2B 差异无统计学意义（P＞0.05），E 组NF-κB、IL-6蛋白表达减少（P均＜0.01），巨噬细胞迁移数量减少（P＜0.01），F、G 组NF-κB、IL-6 蛋白表达差异无统计学意义（P均＞0.05），巨噬细胞迁移数量差异无统计学意义（P＞0.05）。

3 讨论

AS是心脑血管疾病最常见的病理学基础，其引发的心肌梗死及中风等并发症是最常见的死因［8］。巨噬细胞是参与AS发病的重要细胞之一，不仅能吞噬脂类物质，促进炎症细胞因子的分泌，导致AS 斑块的形成，还能结合活化的内皮细胞并迁移到内膜层，从而加重AS 病变过程［9］。组蛋白泛素化在基因转录后的修复过程和调节细胞稳态中扮演重要角色，是基因表观遗传学的重要成员［10］。基因表观遗传学已成为AS 新的研究领域［4］，AS 除了与脂质沉积、炎症反应等有关外，基因表观遗传学也参与其中［11］。

本研究观察发现，在ox-LDL 刺激的巨噬细胞中，与对照细胞相比，ox-LDL 巨噬细胞迁移数目增多，且伴有RNF20 和H2Bub 的降低，提示在AS 形成过程中，组蛋白泛素化酶RNF20 减少，使H2Bub 表达减少，经组蛋白修饰表观遗传学促进巨噬细胞迁移。研究表明，RNF20 调控H2Bub 影响慢性炎症及癌症进展，如在肺癌和卵巢癌中RNF20 及H2Bub 表达降低［12-13］，与本实验结果相似。

基因表观遗传学研究内容主要包含DNA 甲基化和组蛋白修饰等［14］。组蛋白是真核生物染色体的结构蛋白，分为组蛋白H1（H1）、组蛋白H2A（H2A）、组蛋白H2B（H2B）、组蛋白H3（H3）和组蛋白H4（H4）五种。真核细胞中的DNA 以染色质的形式存在，染色质的基本组成单位是核小体，核小体由8个核心组蛋白（两个H2A、H2B、H3、H4）和145～147个DNA 碱基对组成，H1 结合于核小体之间的连接DNA 上，使核小体紧密相连［15］。核小体中的核心处于比较稳定的状态，组蛋白的C 末端和N 末端可伸展到核小体外，发生泛素化等修饰［16］。组蛋白经过泛素化修饰后使染色质的结构改变，影响了其与下游蛋白的相互作用，此外还可与甲基化及乙酰化等修饰协同作用，共同调控人体精细的生命活动［17］。本研究发现，ox-LDL 刺激的巨噬细胞中RNF20 及H2Bub 表达降低，这提示RNF20 可能修改H2Bub 修饰基因表观遗传学从而影响ox-LDL 刺激的巨噬细胞迁移。本研究结果表明，在过表达RNF20 后，H2Bub 表达增加，NF-κB 和IL-6 表达被抑制，且巨噬细胞迁移数量减少，提示RNF20 可影响组蛋白H2Bub 基因表观遗传学，从而对巨噬细胞迁移及炎症因子进行调控。

此外本实验发现，在ox-LDL 刺激的巨噬细胞中NF-κB 和IL-6 表达增加。本实验进一步在ox-LDL的巨噬细胞炎症迁移模型中，加入多种炎症通路的特异性抑制剂。结果显示RNF20 及H2Bub 表达量无明显改变，在加入NF-κB 通路抑制剂SN50 后，IL-6 表达下降且伴有巨噬细胞迁移数量减少，而在加入SB203580（p38 通路抑制剂）和LY294002（PI3K通路抑制剂）并未观察到这种改变。说明NF-κB 是H2Bub修饰基因表观遗传学参与巨噬细胞炎症反应及巨噬细胞迁移的必经途径。NF-κB 是核转录因子，在免疫调节、炎症反应中发挥重要作用［18］。NFκB 在正常血管中含量极低，在AS 中的巨噬细胞中NF-κB 含量明显增高，表明NF-κB 参与AS 的调控［19］。NF-κB 信号通路能够活化TNF-α、IL-6、IL-8等细胞炎性因子的表达从而加重炎症反应［20］。

综上所述，组蛋白的泛素化作为基因表观遗传学的重要组成部分调控巨噬细胞炎症及迁移反应，进而影响AS 的形成和发展。当RNF20 减少时，H2Bub减少，可促进巨噬细胞迁移及炎症因子表达，从而促发AS 进展，此过程经过NF-κB 途径发挥作用。