非小细胞肺癌组织中miR-130a、GOLPH3表达变化及意义

宋金霞，秦虹，阎倩，蔡宏剑，杜以萍

青岛市第八人民医院肿瘤血液科，山东青岛266000

摘要：目的 探讨非小细胞肺癌（NSCLC）癌组织中微小RNA（miR）-130a、高尔基磷蛋白3（GOLPH3）表达及临床意义。方法 选取87 例NSCLC 患者为研究对象，应用 荧光定量PCR 检测NSCLC 癌和癌旁组织中miR-130a、GOLPH3 mRNA 表达；采用免疫组化法检测癌和癌旁组织中GOLPH3 蛋白表达。采用Pearson 线性相关分析miR-130a、GOLPH3 mRNA 表达的相关性，统计 分析miR-130a、GOLPH3 mRNA 表达与患者临床病理参数的关系。采用Kaplan-Meier 生存分析miR-130a、GOLPH3 表达对NSCLC 患者预后的影响，采用 Cox 回归分析影响NSCLC 患者生存预后的危险因素。结果 与癌旁组织相比，NSCLC 癌组织中miR-130a 表达较低，而GOLPH3 mRNA 及蛋白表达较高（P 均＜0.05）。NSCLC 癌组织中miR-130a 表达与GOLPH3 mRNA 表达呈负相关（r=-0.457，P＜0.05）。miR-130a、GOLPH3 mRNA 表达与肿瘤TNM 分期及淋巴结转移有关（P均＜0.05）。miR-130a低表达、GOLPH3高表达的NSCLC患者3年生存率低于miR-130a高表达、GOLPH3低表达患者（P均＜0.05）。TNM 分期、淋巴结转移、miR-130a低表达及GOLPH3高表达是NSCLC 患者不良预后的独立危险因素（P 均＜0.05）。结论 NSCLC 癌组织中miR-130a表达降低、GOLPH3表达升高，检测 二者表达有助于NSCLC病情判断及预后评估。

关键词：非小细胞肺癌；微小RNA-130a；高尔基磷蛋白3；转移；预后

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2022.10.004

中图分类号：R734.2文献标志码：A文章编号：1002-266X（2022）10-0015-05

肺癌是全球最常见的恶性肿瘤，每年新发病患者数达180 万，死亡患者数达159 万［1］。非小细胞肺癌（NSCLC）是肺癌最常见的类型，虽然近年来新的治疗模式及治疗药物研究取得较大进展，NSCLC 患者的临床预后有所改善，但患者5 年生存率仅20%［2］。深入研究NSCLC 疾病机制，对于改善患者临床预后有重要意义。微小RNA（miR）是长度19～23 个核苷酸的分子，能转录后调控基因表达，在细胞分化、增殖等过程中发挥重要作用［3］。miR-130a基因位于15号染色体。研究报道，miR-130a在宫颈癌、肝癌等恶性肿瘤中异常表达下调，通过调控磷脂酰肌醇三激酶/AKT 通路，促进肿瘤增殖及转移等［4-5］。高尔基磷蛋白3（GOLPH3）基因位于5p13.3，编码蛋白质高尔基体的外周膜蛋白，能维持高尔基体带状结构、囊泡运输和高尔基体糖基化。研究表明，GOLPH3在包括黑色素瘤、肺癌等多种实体瘤类型中表达升高，促进癌症相关糖蛋白的糖基化，与多种肿瘤的不良预后密切相关［6-7］。2017 年1月—2018 年9 月，我们检测了NSCLC 癌组织中miR-130a与GOLPH3表达，并分析其临床意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2017 年1 月—2018 年9 月于青岛市第八人民医院诊治的87 例NSCLC 患者的临床资料。纳入标准：①病理组织检查结果明确为NSCLC，有两位病理科医师共同诊断；②既往无放化疗等治疗病史；③资料完整，患者及家属能够配合本研究。排除标准：①伴肺炎、肺脓肿等感染性疾病；②合并其他恶性肿瘤或肿瘤治疗史；③一般状况较差，伴严重脏器功能衰竭。NSCLC 患者男52 例、女35 例，年龄33～78（61.5±6.9）岁；病理类型：腺癌57 例，鳞癌30 例；肿瘤直径：≤5 cm 者53例，＞5 cm 者34 例；肿瘤TNM 分期：Ⅰ～Ⅱ期62 例，Ⅲ期25 例。组织分化程度：高中分化42 例，低分化45 例；伴淋巴结转移24 例，无淋巴结转移63 例。采用门诊定期检查或电话随访的形式追踪患者预后情况，截止随访时间为2021 年9 月。患者均知情并签署同意书，本研究经医院伦理委员会批准（伦理201912014）。

1.2 NSCLC 组织中miR-130a、GOLPH3 mRNA 表达检测 采用RT-qPCR 实验。收集癌和癌旁组织（距癌组织边缘2 cm以上），-80 ℃保存。实验时取30 mg组织标本，液氮中研磨后，TRIzol 法提取组织RNA，Nrodrop1000（美国，赛默飞）鉴定总RNA的浓度及纯度，OD260/OD280为1.8～2.1。以RNA 为模板，反转录为cDNA。以cDNA 为模板，进行qPCR 反应。miR-130a 正向引物：5'-GCCTCCAGAAACGGTCCAG-3'，反向引物：5'-GTCAATACACCCTTTTCCACCA-3'；以U6 为内参基因，正向引物：5'-AGGAAGCCGTTCTTGACAAATG-3'，反向引物：5'-GGCATGAGCCAGGTAAATGAG-3'。 GOLPH3 正 向 引 物 ：5'-CAAGGACCGCGAGGGTTAC-3'，反向引物：5'-TTACGTCTCATTCCACAAGCC-3'；内参基因GAPDH正向引物：5'-CTCACCGGATGCACCAATGTT-3'，反向引物：5'-CGCGTTGCTCACAATGTTCAT-3'。总反应体系20 µL，cDNA 1 µL，正反向引物各1 µL、SYBR Green 10 µL，双蒸水7 µL。反应程序：95 ℃5 min，95 ℃30 s、60 ℃60 s、70 ℃延伸12 s 共40 个循环。结果采用2-ΔΔCt法计算。

1.3 组织中GOLPH3 蛋白表达检测 采用免疫组化法。石蜡包埋组织后切片，二甲苯Ⅰ、Ⅱ脱蜡两遍，各10 min；梯度乙醇水化，各5 min；抗原热修复：柠檬酸缓冲液中微波炉加热至煮沸10 min；内源性过氧化物酶阻断：避光室温滴加3%双氧水；3%羊血清封闭2 h；一抗4 ℃避光过夜（GOLPH3稀释比1∶400，购自Abcam 公司，货号ab236296）；二抗室温孵育30 min；DAB 显色液显色30 s；苏木素染核5 min；盐酸乙醇分化10 s；梯度乙醇脱水，各5 min，中性树脂封片。镜下（×200）观察阳性染色强度和范围，然后进行染色评分，染色评分=染色强度（0 为无染色，1为染色浅，2为染色深）与染色面积（0为≤25%，1为25%～50%，2为≥50%）的乘积评估。评分＜2分为阴性表达，≥2分为阳性表达［8］。

1.4 统计学方法 采用SPSS22.0 统计软件。符合正态分布的计量数据以±s 表示，组间比较采用两独立样本t检验，计数资料以率（%）表示，组间比较采用χ2检验。miR-130a与GOLPH3表达的相关性采用Pearson 线性相关分析。Kaplan-Meier 生存分析miR-130a、GOLPH3 表达与患者生存预后的关系。单因素及多因素Cox回归分析影响NSCLC患者预后的危险因素。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 癌与癌旁组织中miR-130a、GOLPH3 mRNA 表达比较 与癌旁组织相比，NSCLC 癌组织中miR-130a 表达较低（t=29.602，P＜0.05），GOLPH3 mRNA表达较高（t=25.032，P＜0.05）。见表1。

表1 癌与癌旁组织中miR-130a、GOLPH3 mRNA表达比较（±s）

表1 癌与癌旁组织中miR-130a、GOLPH3 mRNA表达比较（±s）

组织癌组织癌旁组织n 87 87 tP GOLPH3 mRNA 1.665±0.302 0.744±0.163 25.032＜0.05 miR-130a 0.631±0.125 1.745±0.328 29.602＜0.05

2.2 癌与癌旁组织中GOLPH3 蛋白表达 NSCLC癌与癌旁组织中GOLPH3 蛋白表达阳性率分别为75.86%（66/87）、17.24%（15/87），癌组织中GOLPH3 蛋白表达阳性率高于癌旁组织中（χ2=60.079，P＜0.05）。

2.3 癌组织中miR-130a 与GOLPH3 mRNA 表达的相关性 NSCLC 癌组织中miR-130a 与GOLPH3 mRNA表达呈负相关（r=-0.457，P＜0.05）。

2.4 miR-130a、GOLPH3 mRNA 表达与NSCLC 患者临床病理参数的关系 NSCLC 癌组织中miR-130a、GOLPH3 mRNA 表达与肿瘤TNM 分期及淋巴结转移有关（P均＜0.05），与性别、年龄、病理类型、肿瘤直径及组织分化程度无关（P均＞0.05）。见表2。

表2 miR-130a、GOLPH3 mRNA表达与NSCLC患者临床病理参数的关系

2.5 miR-130a、GOLPH3表达对NSCLC患者生存预后影响 87 例NSCLC 患者随访过程中死亡31 例，3年总体生存率64.4%（56/87）。以癌组织中miR-130a、GOLPH3 mRNA表达的平均数0.631、1.665为界，分别分为高、低表达两组。miR-130a 低表达组的3 年总体生存率为48.8%（21/43），高表达组为79.5%（35/44），miR-130a 低表达组3 年总体生存率低于高表达组（χ2=5.194，P＜0.05）。GOLPH3 高表达组、低表达组3 年总体生存率分别为43.5%（20/46）、87.8%（36/41），GOLPH3 高表达组3 年总体生存率低于低表达组（χ2=6.034，P＜0.05）。

2.6 影响NSCLC 患者预后的危险因素 以生存状态为因变量（1=死亡，0=存活，t=生存时间），以年龄、性别、肿瘤直径、病理类型、组织分化程度、肿瘤TNM 分期、淋巴结转移、miR-130a、GOLPH3 为自变量。Cox 回归分析结果显示，TNM 分期Ⅲ期、淋巴结转移、miR-130a 低表达、GOLPH3 高表达是影响NSCLC患者不良预后的独立危险因素，见表3。

表3 多因素Cox分析影响NSCLC患者预后的危险因素

3 讨论

我国肺癌疾病负担重，患病率57.26/10 万，致死率45.87/10 万，严重威胁我国人民健康［9］。NSCLC 占肺癌所有类型的80%。目前临床上NSCLC 的治疗方法主要包括手术、放化疗及免疫治疗等。但目前免疫检查点治疗的有效率仅20%［10］。深入研究NSCLC 的疾病机制，寻找能够有效预测患者临床预后的分子标志物，对于临床治疗方案的选择有重要意义。目前评估NSCLC 患者预后的因素包括肿瘤TNM 分期、组织分化程度及淋巴结转移等临床病理因素和肿瘤突变负荷、表皮生长因子受体等癌基因的突变状态等，在评估NSCLC 患者预后、治疗方案选择等方面具有重要的临床价值［11］。

非编码RNA 是蛋白表达功能的一类RNA 分子，根据长度可分为长链非编码RNA 和miRNA［12］。miRNA 广泛参与调控下游靶基因的表达，影响细胞分化发育及衰老等过程，与心血管疾病、自身免疫疾病及肿瘤等关系密切［13］。近年研究发现，肿瘤中miR-130a 作为一种抑癌基因，发挥抑制肿瘤恶性进展的作用［14］。POODINEH 等［15］报道，miR-130a 能通过阻断Wnt 信号通路的信号传导，进而抑制肿瘤的增殖及转移，其低表达与患者的不良预后密切相关。本研究结果表明，NSCLC 癌组织中miR-130a 表达下调，其机制尚不清楚，可能与肿瘤发生时的表观遗传学修饰有关。RAMALHO 等［14］研究报道，肿瘤发生时miR-130a 启动子区域甲基化程度增加，导致miR-130a 表达沉默，进而促进肿瘤细胞的恶性进展。此外，miR-130a 表达与NSCLC 患者肿瘤TNM分期及淋巴结转移有关，提示miR-130a 低表达促进NSCLC的肿瘤进展。DING等［16］研究发现，miR-130a能够抑制肿瘤细胞肿瘤坏死因子α 的表达，而肿瘤坏死因子α能抑制肿瘤微环境中免疫细胞的肿瘤杀伤功能。此外，体外细胞实验表明，miR-130a 表达下调导致Kruppel 样因子3 表达异常升高，而Kruppel 样因子3 促进肺肿瘤细胞的增殖、迁移和转移等行为［17］。本研究结果显示，miR-130a 低表达是患者不良预后的独立危险因素，提示检测NSCLC 癌组织中miR-130a 表达有助于判断患者的临床预后，进而指导临床决策。

GOLPH3 是一种高度保守的蛋白质，相对分子质量为34 kD，GOLPH3在反式高尔基体网络和内体结构之间移动，参与诸多重要细胞过程，如运输、受体再循环和蛋白质糖基化等［18］。近年来，GOLPH3已被证明与肿瘤发生发展有关。GOLPH3过表达可通过增强mTOR 信号通路的活性来促进细胞转化，与多种实体瘤（如胶质瘤和肝细胞肝癌）的不良预后相关［19-20］。然而，GOLPH3 在NSCLC 中的发病机制尚不清楚。本研究中，NSCLC 癌组织中GOLPH3 mRNA 及蛋白表达均明显升高，表明NSCLC 癌组织中GOLPH3 表达升高。GOLPH3 表达受到上游转录因子E2F 的表达调控，NSCLC 发生时，E2F 表达显著上调，其通过结合GOLPH3 启动子区域，促进GOLPH3 的表达［21］。此外，肿瘤中GOLPH3 表达亦受到上游miR-134 的表达调控。研究报道，肿瘤中miR-134 表达下调，致使miR-134 无法结合并抑制GOLPH3 mRNA 表达，导致肿瘤GOLPH3 蛋白表达上调［21］。本研究中，NSCLC 癌组织中GOLPH3 表达与肿瘤分期及淋巴结转移有关，高分期及伴淋巴结转移的癌组织中GOLPH3 表达较高，提示GOLPH3表达促进NSCLC 肿瘤进展。研究报道，GOLPH3 能通过稳定纤溶酶原激活物抑制因子1 表达，促进肿瘤细胞的糖代谢，进而促进肿瘤细胞的增殖［20］。此外，有学者发现，GOLPH3能促进肿瘤细胞中Wnt/β-连环蛋白信号通路的激活，促进下游血管内皮生长因子表达，导致肿瘤细胞侵袭、转移能力增强及肿瘤血管新生［22］。本研究中，GOLPH3 高表达与患者不良预后有关，并且是NSCLC 患者不良预后的独立危险因素。因此，检测癌组织中GOLPH3 表达有助于评估NSCLC 患者的临床预后。本研究进一步分析NSCLC 癌组织中miR-130a 与GOLPH3 表达的相关性，结果两者呈负相关。目前两者间的作用关系尚不清楚，推测其机制可能是miR-130a 负性调控GOLPH3表达。国内有学者在肺癌细胞系中应用双荧光素酶报告实验证实，miR-130a 能靶向结合GOLPH3，并抑制GOLPH3 表达，从而抑制肿瘤细胞的增殖及迁移［23］。因此，miR-130a 与GOLPH3 有望成为NSCLC 中新的分子标志物。本研究尚存在以下不足，一方面，本研究样本例数有限，需今后扩大样本量深入研究；另一方面，本研究是回顾性研究，可能存在一定偏倚，有待设计前瞻性研究进一步验证。

综上所述，NSCLC 患者癌组织中miR-130a 表达下调，而GOLPH3表达上调，两者在癌组织中的表达与肿瘤分期和淋巴结转移有关，共同促进NSCLC 肿瘤的发生发展。