血清miR-103、sCD40L对急性缺血性脑卒中治疗效果及预后评估的价值

韩旭东，梁志刚，阎志慧，张惠龙

1 烟台海港医院神经内科，山东 烟台 264012；2 烟台毓璜顶医院神经内科；3 烟台山医院神经内科

急性缺血性脑卒中（AIS）是最常见的卒中类型，发病急，病情进展快［1］。目前AIS治疗以改善脑循环、抗氧化、清除氧自由基、营养神经等为主，疗效评估主要依赖于美国国立卫生研究院卒中量表（NIHSS）评分［2］，存在主观性强、重复性差的弊端，而准确判断AIS治疗效果对进一步治疗和预后评估均有重要意义。动脉粥样硬化是推动大中型动脉病变的主要原因，与AIS发病、神经功能恶化密切相关［3］。微小核糖核酸-103（miR-103）可通过靶向长链非编码RNA-WDR59促使内皮细胞损伤，还可靶向Kruppel样因子4促进促炎因子和趋化因子表达，参与动脉粥样硬化过程［4-5］。可溶性CD40 配体（sCD40L）主要来源于活化的血小板，与动脉粥样硬化和血栓形成事件有关［6］。2019年2月—2021年1月，我们探讨了血清miR-103、sCD40L在AIS患者疗效判断和预后评估中的价值。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2019 年2 月—2021 年1 月烟台海港医院收治的142 例AIS 患者（AIS 组），其中男92 例、女50 例，年龄（62.75±3.71）岁、体质量指数（23.95±2.18）kg/m2，有吸烟史77例、饮酒史83例。纳入标准：①符合《中国急性缺血性脑卒中诊治指南2018》诊断流程和标准［7］；②起病至入院时间＜24 h；③入院后接受抗血小板、扩血管、营养脑神经等AIS常规治疗。排除标准：①合并中枢神经系统感染、脱髓鞘疾病、运动障碍性疾病等其他神经系统疾病者；②合并严重心血管疾病，恶性肿瘤，肝肾功能障碍者；③凝血功能障碍，不能耐受抗血小板治疗者；④随访失联者。另选择70 例同期于我院体检的查体健康者为对照组，均排除心脑血管疾病，其中男41例、女29 例，年龄（62.19 ± 3.02）岁、体质量指数（23.51±2.07）kg/m2，有吸烟史35例、饮酒史38例。两组临床基线资料均衡可比（P均＞0.05）。受试者均知情同意并签署同意书。本研究通过医院伦理委员会批准（2021141）。

1.2 临床治疗及效果评价 患者均接受静脉溶栓、机械取栓或抗血小板治疗，并给予依达拉奉（30 mg+5.00%葡萄糖注射液100 mL 静脉滴注，2 次/天）清除氧自由基，甲钴胺（每次0.5 mg，3 次/天，口服）营养脑神经。根据患者合并基础疾病情况给予降糖（皮下胰岛素注射）、降压（卡托普利）或调脂（阿托伐他汀钙）治疗等，连续治疗2周。2周后参考文献［8］方法进行疗效评价：NIHSS 评分减少91.00%～100.00%，残疾程度0 级为痊愈；NIHSS 评分减少46.00%～90.00%，残疾程度1～3 级为显效；NIHSS评分减少18.00%～45.00%，临床症状有所好转为有效；NIHSS 评分减少＜18.00%或增加＞18.00%，甚至死亡为无效。有效=痊愈+显效+有效，根据治疗效果将患者分为有效组（106例）和无效组（36例）。

1.3 血清miR-103、sCD40L 检测 所有AIS 患者分别于治疗前、治疗3 d、治疗7 d、治疗14 d，对照组于体检当日采集血标本，取血液凝固后上层血清离心（3 000 r/min，半径15 cm，时间10 min）处理后冷冻保存待检。取血清样本加入TRIzol（美国Invitrogen公司）提取总RNA，NanoDrop-1000 紫外分光光度计（NanoDrop公司）检测RNA纯度和浓度。取20µg总RNA，采用M-MLV 逆转录酶（Epicentre 公司）将RNA 逆转录为cDNA。采用实时荧光RT-qPCR 法检测血清miR-103表达：CFX96实时荧光PCR 仪（美国Bio-Rad公司），引物设计由金域医学检验中心完成。miR-103 正向引物：5'-TGATGCTGGTGCTAGAAGT-3'，反向引物：：5'-TCTCCACAGAACAGGCAAG-3'；U6 正向引物：5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3'，反向引物：5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'。反应条件：95 ℃预变性3 min，95 ℃变性15 s、65 ℃退火20 s、75 ℃延伸15 s共40个循环。扩增反应结束后进行熔解曲线分析，共做3 次平行试验。以U6为内参，采用2-ΔΔCt法计算miR-103相对表达量。取血清样本，采用Multiskan SkyHigh 全波长酶标仪（美国赛默飞公司）运用酶联免疫吸附试验检测血清sCD40L水，试剂盒购自上海纪纳生物有限公司（批号201930）。

1.4 预后观察 患者出院后定期电话随访，嘱不适随诊，指导患者按时按量服用抗血小板、降压和降糖药物。出院3 个月后采用改良RANKIN 量表（mRS评分）［9］评价患者残疾程度，分为0～5 共6 个等级，0、1分为无明显残疾；2分为轻度残疾；3分为中度残疾；4分为重度残疾；5分为严重残疾。0、1分患者归为神经预后良好组（99 例），2～5 分归为神经预后不良组（43例）。

1.5 统计学方法 采用SPSS22.0 统计软件。符合正态分布计量资料以-x±s表示，比较采用重复测量数据方差分析或独立样本t检验。计数资料以例（%）表示，比较采用χ2检验。Logistic 逐步回归分析AIS 患者预后不良的危险因素。采用受试者工作特征（ROC）曲线分析miR-103、sCD40 评估AIS 患者治疗效果及预后评估的价值。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 AIS组和对照组血清miR-103、sCD40L比较 AIS组与对照组血清miR-103 水平分别为3.29 ± 0.61、1.42 ± 0.38，血清sCD40L 水平分别为（362.77 ±62.18）、（83.26 ± 13.47）pg/mL，AIS 组血清miR-103、sCD40L水平均高于对照组（P均＜0.05）。

2.2 不同疗效组治疗期间血清miR-103、sCD40L比较 两组治疗前后血清miR-103 表达、sCD40L 水平差异有统计学意义（F组间分别为23.251、32.0541，P组间＜0.05），有效组治疗后血清miR-103 表达、sCD40L 水平先升高后下降（F时间分别为31.091、27.025，P时间＜0.05），无效组治疗后血清miR-103 表达、sCD40L 水平治疗前后比较差异无统计学意义（F时间分别为2.091、2.025，P时间均＞0.05）。两组间存在交互效应（F交互分别为29.668、25.032，P交互＜0.05），两组治疗前、治疗3 d 血清miR-103 表达、sCD40L 水平比较无统计学差异（P均＞0.05），有效组治疗7 d、治疗14 d 血清miR-103 表达、sCD40L 水平低于无效组（P均＜0.05），见表1。

表1 两组治疗期间血清miR-103表达、sCD40L水平比较（-x ± s）

2.3 影响AIS 患者预后的因素分析 预后不良组年龄、大梗死比例、心房颤动、NIHSS评分、发病至入院时间、总胆固醇（TC）、空腹血糖（FPG）、糖化血红蛋白（HbA1c）、治疗14 d 血清miR-103、治疗14 d 血清sCD40L 高于预后良好组（P均＜0.05），两组性别、体质量指数、吸烟史、饮酒史、高血压、糖尿病、高血脂症、左心房血栓形成、梗死部位、心率、收缩压、舒张压、TG、HDL-C、LDL-C 治疗3、7 d 的miR-103、sCD40L 比较差异均无统计学意义（P均＞0.05），其他指标比较见表2。以AIS 患者预后为因变量（赋值：预后良好=0，预后不良=1），以年龄、病变大小（赋值：腔隙性梗死=1，小梗死=2，大梗死=3）、心房颤动（赋值：否=0，是=1）、发病至入院时间、LDL-C、HbA1c，收缩压、舒张压、NIHSS 评分、TC、FPG、治疗14 d 血清miR-103、治疗14 d 血清sCD40L 为自变量，逐步法排除无关变量，Logistic 逐步回归分析发现，NIHSS评分、治疗14 d 血清miR-103、治疗14 d血清sCD40L 是AIS 患者预后不良的危险因素（P均＜0.05），见表3。

表2 影响AIS患者预后的单因素分析

表3 影响AIS患者预后的Logistic回归分析

2.4 miR-103、sCD40L 判断AIS 治疗疗效及预测患者预后的价值 治疗7、14 d 的miR-103、sCD40L判断AIS 治疗疗效的最佳截断值分别为2.15、336.32 pg/mL、2.03、316.35 pg/mL，曲线下面积（AUC）分别为0.756、0.724、0.592、0.572。治疗7 d miR-103 联合sCD40L 判断AIS 治疗疗效的AUC为0.875，高于治疗7 d miR-103、sCD40L单独（Z分别为2.513、3.146，P均＜0.05）。治疗14 d miR-103、sCD40L 预测AIS 患者预后的最佳截断值分别为2.95、312.16 pg/mL，AUC分别为0.763、0.732，治疗14 d miR-103 联合sCD40L 预测AIS 患者预后的AUC为0.854，高于治疗14 d miR-103、sCD40L 单独判断（Z分别为2.201、2.543，P均＜0.05），见表4。

表4 miR-103、sCD40L判断AIS治疗疗效及预测患者预后的效能

3 讨论

AIS 是脑组织血液供应异常导致的脑缺血性疾病，可引起神经细胞坏死或凋亡，出现相应的神经缺损症状，最终遗留残疾甚至引起患者死亡。高龄、肥胖、高血压、糖尿病、冠心病、吸烟等是AIS 发病的高危因素［10］。动脉粥样硬化是AIS 发病、进展以及复发的主要原因，动脉粥样硬化斑块脱落可引起脑血管堵塞以及相应脑组织缺血缺氧，神经细胞凋亡和坏死，影响神经功能障碍［11］。

miRNAs 是短、单链、非编码RNA，通过与信使RNA 相互作用影响蛋白质合成调控基因转录后表达，某些miRNAs 通过调节动脉粥样硬化易感基因及其转录后基因表达，影响细胞内合成蛋白质水平，引起内皮细胞、平滑肌细胞和白细胞失调，促使动脉粥样硬化斑块形成［12］。miR-103是miR-15/107家族成员。现有报道显示，miR-103 通过靶向长链非编码RNA WDR59 表达，增加增殖内皮细胞对氧化低密度脂蛋白诱导的有丝分裂畸变的易感性，促进内皮适应不良，血管炎症及动脉粥样硬化的发生［13］。本研究发现，治疗有效组miR-103 表达于治疗7 d 后下降，但无效组并无统计学差异，说明miR-103 表达与AIS疗效存在密切关系。ROC 曲线分析结果示治疗7 d血清miR-103表达判断AIS临床疗效的价值最高，分析原因为治疗7 d后多数治疗有效患者病情基本趋于稳定，此时检测血清miR-103 表达可更好地鉴别不同疗效患者。Logistic 逐步回归分析发现，miR-103 表达增高是AIS 患者神经预后不良的危险因素。唐蕾等［5］认为，miR-103 表达上调与AIS 患者神经功能恶化有关。分析原因为miR-103 可促使海马神经元中核因子-κB 活化，诱导神经细胞坏死凋亡［14］，miR-103 还可靶向抑制血管内皮生长因子，抑制新生血管形成，导致脑梗死体积增加［15］，促使神经功能恶化。

sCD40L 是CD40 的可溶性配体，来源于活化血小板，具有促炎和促凝作用，在颈动脉、肾动脉、冠状动脉粥样硬化中增加，被认为是心血管疾病的潜在生物学指标［16］。本研究发现，血清sCD40L 水平与AIS治疗效果有关，治疗7天血清sCD40L水平在AIS治疗效果评估中具有较高价值，治疗14 天sCD40L水平增高是AIS 患者神经预后不良的危险因素，提示sCD40L 可作为AIS 疗效判断和预后评估的指标。推测sCD40L 参与AIS 患者不良预后的机制：CD40/CD40L通过激活炎症和凝血反应导致血管疾病和动脉粥样硬化，血小板表面CD40L和sCD40L表达可促使胶原蛋白释放，胶原蛋白诱导p38 MAP激酶、细胞外信号调节激酶1/2和热休克蛋白27磷酸化、基质金属蛋白酶-2表达，活性氧产生，促使动脉粥样硬化形成［17］。其次，sCD40L 还通过糖蛋白Ⅱb/Ⅲa 配体依赖性机制刺激血小板活化，导致和加强血小板—白细胞黏附，募集白细胞到血栓部位，加剧局部炎症反应，促使动脉粥样硬化和血栓形成［18］，最终引起AIS 神经功能恶化和不良结局的发生。本研究miR-103、sCD40L在治疗3 d时增高可能原因为尚处于病情进展阶段，随着溶栓、抗血小板治疗后脑缺血症状得以控制，miR-103表达逐渐降低

综上所述，AIS 治疗无效、预后不良患者血清miR-103 表达、sCD40L 水平均增高，miR-103、sCD40L 增高是AIS 患者预后不良的危险因素。治疗7 d miR-103、sCD40L 可用于判断AIS 治疗效果，治疗14 d miR-103、sCD40L 可作为AIS 患者预后评估的潜在指标，miR-103 联合sCD40L 可提高疗效判断和预后评估的效能。本研究局限之处在于样本量偏少，可能存在统计学偏倚，尚待进一步扩大样本量加以证实。