CD14-TLR4-NF-κB信号传导通路在脂多糖诱导ALI/ARDS中的作用及机制研究

金肇权，张文彬，陈欣，朱滨

急性肺损伤（acute lung injury，ALI）是由多种致病因素所导致的肺泡上皮细胞及毛细血管内皮细胞受损，可造成弥漫性肺间质及肺泡水肿，最终引起急性低氧性呼吸功能不全［1-2］。随着病情进一步恶化，ALI 常演变为急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）［3］，临床症状主要表现为顽固性低氧血症，具有较高的致死率［4］。ALI/ARDS 既是多种呼吸道重症的发病基础，又是全身炎症活动剧烈时较易出现的综合征［5］。近年来，ALI/ARDS 的发生发展机制及其影响因素已成为临床研究热点问题。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是由脂质和多糖所构成的复合物，有研究表明，脂多糖常通过Toll 样受体（toll-like receptors，TLR）家族参与机体炎性活动和免疫反应，与机体多种炎性疾病的发生发展密切相关［6］。另据研究显示，白细胞分化抗原14（leukocyte differentiation antigen 14，CD14）作为脂多糖受体，其主要生物学活性是识别、结合脂多糖复合物，参与、把控脂多糖性细胞反应［7］；TLR4 作为TLR 家族的主要成员之一，是参与非特异性免疫应答反应和炎症反应的主要蛋白质因子［8］；而核因子激活的B 细胞的κ-轻链增强（enhancement of kappa light chain in nuclear factor activated B cells，NF-κB）通过结合多种炎性细胞因子或肿瘤坏死因子，参与机体各种炎症活动，并与多种炎症疾病的发生发展密切相关［9］。但目前临床鲜有研究探讨过CD14、TLR4、NF-κB 以及脂多糖等细胞因子在ALI/ARDS 发病中的作用，本次研究以此目标为出发点，对大鼠进行ALI/ARDS 造模实验，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料清洁级健康雄性SD 大鼠90 只，8～10周，体质量（187.52±5.16）g，购买于北京宝元兴业科技有限公司［SYXK（京）2020-0167］。本研究符合一般动物实验伦理学原则。

1.2 动物分组与实验方法将90只SD大鼠随机分为A、B、C 三组，每组各30 只。A 组和B 组大鼠在左侧尾静脉部位注射内毒素9 mg/kg，制造大鼠ALI/ARDS 模型。C 组大鼠静脉注射生理盐水。给予A组大鼠CD14 模拟物、TLR4 模拟物以及NF-κB 模拟物静脉注射。取大鼠肺组织，留取一半肺组织，4%甲醛溶液固定，用于病理染色；剩余组织置于液氮中速冻后置于-80 ℃超低温冰箱保存，用于蛋白质印迹法检测。

1.3 仪器与试剂大鼠sEPCR 检测试剂盒（上海信裕生物工程有限公司）；Trizol试剂（武汉科昊佳生物科技有限公司）；Lipofectamine 2000 转染试剂［上海赛默飞世尔科技（中国）有限公司］；血液分析仪（日本SYSMEX）及配套试剂检测血常规指标；全自动生化分析仪（北京普朗新技术有限公司）；大鼠肺功能仪（北京广源达科技发展有限公司）；血气电解质分析仪（南京普朗医疗设备有限公司）。

1.4 CD14、TLR4、NF-κB P65 和脂多糖样本收集和检测方法CD14、TLR4、NF-κB P65 和脂多糖蛋白表达：采用蛋白质印迹法。取部分梗阻侧肾组织标本，匀浆器充分研磨后加入裂解液裂解并提取总蛋白，采用BCA 法测定蛋白浓度。根据目标蛋白大小配置适合浓度的凝胶、分离胶和浓缩胶。电泳加压转膜后脱脂奶粉封闭1 h。加入特异性CD14 抗体、TLR4 抗体、NF-κB P65 抗体和脂多糖抗体，稀释比例为1∶1 000，以β-actin（1∶5 000）作为对照。去除一抗，洗涤后加入二抗，室温孵育2 h，漂洗，化学发光法X 线片显影，采用Image J 软件得到条带灰度值，计算蛋白相对表达量。

1.5 HE 染色（1）甲醛固定的肺组织采用石蜡包埋的方法制备成厚度5～7 μm 的石蜡病理切片，检测时先行脱蜡水化，水化后的肺组织切片放入苏木精水溶液中染色3 min。（2）流水冲洗掉多余的苏木精，1%的盐酸乙醇分化5～8 s，0.6%氨水返蓝5～8 s。（3）流水冲洗1 h 后入蒸馏水片刻。（4）70%和90%乙醇中脱水各10 min。（5）乙醇伊红染色液染色2～3 min。（6）染色后的切片经纯乙醇脱水，经二甲苯使切片透明。（7）将已透明的切片滴上加拿大树胶，盖上盖玻片封固。

1.6 观察指标（1）三组大鼠造模后呼吸频率（respiratory rate，RR）、动脉血氧分压（arterial partial pressure of oxygen，PaO2）：采用大鼠肺功能仪对大鼠RR 进行检测，于造模后采集大鼠动脉血5 mL，并采用血气电解质分析仪对其PaO2进行分析；（2）三组大鼠的CD14、TLR4、NF-κB P65 和脂多糖蛋白表达水平；（3）三组大鼠的CD14、TLR4、NF-κB P65 和脂多糖蛋白相关性；（4）HE 染色结果；（5）肺组织损伤Murray 评分［10］：主要根据低氧血症评分、呼气末正压及肺顺应性等指标，各项评分均为0～4 分。肺组织损伤评分为四项结果评分相累加。

1.7 统计学方法采用SPSS 22.0 系统软件分析，其中符合正态分布的计量资料以表示，三组间比较采用方差检验，差异有统计学意义者进一步采用事后LSD-t检验分析两两间差异；Pearson 相关系数分析CD14 蛋白、TLR4 蛋白、NF-κB P65 蛋白和脂多糖蛋白的相关性，P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠造模后RR、PaO2分析造模12 h 后，在三组大鼠的RR方面：A组＞B组＞C组，组间均差异有统计学意义（均P＜0.001）；而在PaO2方面：A 组＜B 组＜C 组，各组间均差异有统计学意义（均P＜0.001），见表1。

表1 90只大鼠造模12 h后的RR与PaO2比较/

表1 90只大鼠造模12 h后的RR与PaO2比较/

注：RR为呼吸频率，PaO2为血氧分压。①与A组比较，P＜0.001。②与B组比较，P＜0.001。

2.2 三组大鼠的CD14、TLR4、NF-κB P65 和脂多糖蛋白表达对比CD14 蛋白、TLR4 蛋白、NF-κB P65 蛋白和脂多糖蛋白表达方面：A 组＞B 组＞C 组，任意两组间的均差异有统计学意义（均P＜0.001），见表2。

表2 90只大鼠的CD14、TLR4、NF-κB P65和脂多糖蛋白表达对比/

表2 90只大鼠的CD14、TLR4、NF-κB P65和脂多糖蛋白表达对比/

注：CD14 为白细胞分化抗原14，TLR4 为趋化因子受体4，NFκB P65为核因子-κB P65。①与A组比较，P＜0.001。②与B组比较，P＜0.001。

2.3 A 组大鼠实验后的CD14、TLR4、NF-κB P65和脂多糖蛋白相关性研究Pearson 相关性分析显示，A 组大鼠的脂多糖蛋白分别与CD14 蛋白、TLR4蛋白以及NF-κB P65 蛋白均呈正相关（P＜0.05），见表3、图1。

图1 急性肺损伤大鼠各蛋白与脂多糖蛋白（LPS）相关性：A为白细胞分化抗原14（CD14）蛋白；B为趋化因子受体4（TLR4）蛋白；C为核因子-κB（NF-κB P65）蛋白

表3 急性肺损伤大鼠实验后的白细胞分化抗原14（CD14）、趋化因子受体4（TLR4）、核因子-κB（NF-κB P65）和脂多糖蛋白相关性研究

2.4 HE 染色图光镜下可见C 组大鼠肺组织切片肺泡结构较为清楚，未发生炎性细胞渗出、浸润。B组大鼠可见较为明显的肺灶性出血，肺泡和肺间质水肿，并且存在较多的炎性细胞浸润。A 组大鼠可见肺灶性出血、肺泡和肺间质水肿以及炎性细胞浸润情况较B组更为严重。

2.5 肺组织损伤评分肺组织损伤评分方面：A 组为（14.73±0.52）分，B 组为（9.54±0.37）分，C 组为（5.38±0.07）分，且A＞B＞C，三组比较差异有统计学意义（F=479.13，P=0.001），B 组与A 组、C 组比较，均P＜0.001。

3 讨论

ALI/ARDS 是临床上较为常见的肺部危重症之一，具有一定的致死率［11］。近年来，随着我国人口老龄化进程的加速，社会工业化的不断发展以及空气污染的日益严峻，ALI/ARDS 发病率呈不断上升趋势［12］。ALI/ARDS 作为一种临床综合征，好发于创伤、休克和感染等病人中，其主要临床症状表现为呼吸窘迫以及顽固性低氧血症［13］。目前，临床治疗方案主要包括药物疗法配合氧疗、机械通气等对ALI/ARDS 病人进行治疗，但部分病人因病情较重或治疗方式不当，治疗效果较差［14］。但目前临床关于影响ALI/ARDS 发生发展因素及其作用机制尚未明确，而相关研究表明炎症反应可能是影响ALI/ARDS 发病的重要因素之一［3］。本研究对大鼠进行ALI/ARDS 模型培养，并给予部分ALI/ARDS 模型大鼠CD14 模拟物、TLR4 模拟物以及NF-κB 模拟物静脉注射，旨在观察CD14-TLR4-NF-κB 信号传导通路在脂多糖诱导ALI/ARDS中作用及机制。

本研究结果显示，ALI/ARDS 模型组大鼠造模后的RR 明显高于正常组大鼠，而PaO2则明显低于正常组大鼠，尤其是经模拟物转染组大鼠，其变化幅度进一步扩大，这与武昊天等［15］研究结果相一致。RR 是指单位时间内的呼吸次数，其呼吸频率明显加快表明机体出现呼吸窘迫现象，是ALI/ARDS 等肺部疾病的主要症状之一［16］。PaO2即动脉血中氧分子物理溶解时出现的张力，主要反映了机体是否缺氧以及缺氧的程度。PaO2明显降低在一定程度上反映了机体存在缺氧状况，同样是ALI/ARDS等肺部疾病的常见临床症状［17］。因此，研究结果表明了大鼠ALI/ARDS 造模成功，而经CD14 模拟物、TLR4 模拟物以及NF-κB 模拟物转染后，大鼠病变程度进一步加重，反映了这3 项因子对大鼠机体炎性活动和ALI/ARDS病情恶化的促进作用。CD14作为脂多糖的受体，由糖蛋白构成，能够识别、结合脂多糖，还可作为革兰阴性或阳性细菌等其他产物的受体，在炎症反应、内毒素休克等病理反应中均具有重要作用。TLR4作为TLR4家族的主要成员之一，对获得性免疫应答反应具有调控作用，其活化后将激活机体抗微生物防御系统，产生IL-6 和TNF以及趋化型细胞因子，并最终参与机体炎症反应。NF-κB P65 作为NF-κB 家族重要一员，参与细胞对外界刺激的响应，如细胞因子、辐射、重金属、病毒等，在炎症反应、免疫应答等过程中均起到关键作用。Ness T 等［18］在研究中发现，CD14-TLR4-NF-κB信号传导通路与机体炎症反应和免疫应答等密切相关，本研究结果表明增强CD14-TLR4-NF-κB 信号传导通路能够加剧ALI/ARDS 模型大鼠的病情恶化程度。

本研究对造模后三组大鼠的CD14、TLR4、NFκB P65 和脂多糖蛋白表达做出比较，结果显示，大鼠ALI/ARDS 造模后，其CD14、TLR4、NF-κB P65 和脂多糖的蛋白表达均明显上升，尤其是给予模拟物注射组模型大鼠，其变化幅度更大，这与Wu 等［19］学者的研究结果相一致。本研究还对模拟物注射组模型大鼠的脂多糖蛋白与CD14 蛋白、TLR4 蛋白、NF-κB P65 蛋白的相关性作出探讨，结果显示均呈正相关。脂多糖主要由多糖和脂质构成，脂多糖主要通过诱导存在于目标细胞的细胞膜中的TLR4 来表现其作用［20］。TLR4 与内毒素结合蛋白共同作用捕获脂多糖，并将其然后将其输送给CD14 和NFκB P65 分子，最终作用于机体炎症活动与免疫反应［21］。研究结果说明，增强CD14-TLR4-NF-κB 信号传导通路能够通过诱导脂多糖类因子的表达上升，并最终加快机体ALI/ARDS 病情发展与恶化。本研究还对三组大鼠造模后的肺组织切片进行染色，结果显示经模拟物转染后，其肺灶性出血、肺泡和肺间质水肿以及炎性细胞浸润情况较普通ALI/ARDS模型组大鼠更为严重，而其肺组织损伤程度也更为严重。上述研究结果说明经模拟物转染后，大鼠的ALI/ARDS相关炎性活动更加显著。

综上所述，CD14-TLR4-NF-κB 信号传导通路能够增强脂多糖表达并促进机体的炎性活动，参与ALI/ARDS 的发生、发展。本研究尚存在一些不足之处，本研究仅对CD14-TLR4-NF-κB 信号传导通路在大鼠ALI/ARDS 中作用及机制进行了探讨，未来的研究中可以取手术治疗的ALI/ARDS 病人的病变肺组织切片进行转染，观察其转染后病变情况，以便更好地为临床提供依据。