微小RNA-141-3p靶向调控含CUE结构域蛋白2基因对雨蛙素诱导的大鼠胰腺腺泡细胞损伤的影响

佘正元，司晓明

急性胰腺炎发生过程中，凋亡和坏死是胰腺腺泡细胞死亡的主要形式［1-2］。然而，急性胰腺炎胰腺腺泡细胞凋亡的分子机制尚不清楚。微小RNA（microRNAs）是一类高度保守的长度为18 至22 个核苷酸非编码RNA，其可在转录后水平调控下游靶基因水平，参与组织生长、疾病发生和恶化过程［3］。已有研究表明，急性胰腺炎病人血清中微小RNA-141-3p（miR-141-3p）的表达水平显著升高［4］，但miR-141-3p对急性胰腺炎胰腺腺泡细胞凋亡和炎症反应的影响尚不清楚。含CUE 结构域蛋白2（CUE domain containing 2 protein，CUEDC2）是一种多功能蛋白，其通过调控细胞周期、炎症反应、信号传导等途径影响细胞的病理生理过程。近年研究发现，CUEDC2在雨蛙素诱导的急性胰腺炎细胞模型中表达上调，过表达CUEDC2促进胰腺腺泡细胞凋亡，降低肿瘤坏死因子α（TNF-α）及白细胞介素-6（IL-6）水平等促炎因子分泌［5-6］。生物信息学分析显示，miR-141-3p 可能与CUEDC2 存在相互作用，但miR-141-3p 能否调控CUEDC2表达参与胰腺腺泡细胞凋亡和炎症反应尚未可知。因此，2018 年7 月至2019 年12 月，从美国ATCC 购买大鼠胰腺腺泡细胞AR42J。本研究拟构建急性胰腺炎细胞模型，探讨miR-141-3p 对腺泡细胞凋亡和炎症反应的影响及机制，以期为临床诊断和治疗胰腺炎提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料大鼠胰腺腺泡细胞AR42J 购于美国ATCC；胎牛血清和RPMI-1640 培养基购于美国Hyclone 公司；雨蛙素和TRIZOL 试剂购于美国Sigma 公司；miR 抑制物阴性对照（anti-miR-NC）、miR-141-3p 抑制物（anti-miR-141-3p）、空载体（pcDNA）、CUEDC2 过表达载体（pcDNA-CUEDC2）、小干扰RNA 对照（si-NC）、CUEDC2小干扰RNA（si-CUEDC2）、野生型（WT）荧光素酶报告基因载体（WT-CUEDC2）和突变型（MUT）荧光素酶报告基因载体（MUT-CUEDC2）购于上海吉玛制药有限公司；互补DNA（cDNA）第一链合成试剂盒、一步法miRNA 反转录试剂盒购于北京天根生化科技有限公司；CUEDC2抗体、B 细胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）抗体、Bcl-2相关X蛋白（Bax）抗体、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）抗体，以及Ⅱ抗购于美国CST 公司。放射免疫沉淀法（RIPA）裂解液、二喹啉甲酸（BCA）试剂盒以及聚偏二氟乙烯膜购于上海碧云天生物科技有限公司；TNF-α 和IL-6 酶联免疫吸附试验（Elisa）检测试剂盒购于南京森贝伽生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养和建模 采用RPMI-1640 培养基（含有体积分数为10%的胎牛血清）在37 ℃、二氧化碳体积分数为5%的恒温培养箱培养AR42J 细胞。当细胞汇合度达到80时进行传代。参照文献［7］构建急性胰腺炎细胞模型：将AR42J 细胞按照每孔1×106个细胞的密度接种于6 孔板，当细胞汇合度达到60%时，用100 nm/L 的雨蛙素刺激AR42J 细胞6 h，收集细胞，流式细胞术检测细胞凋亡情况。收集细胞上清液，Elisa 试剂盒检测检测上清液中TNF-α 和IL-6的表达水平。

1.2.2 细胞转染和实验分组 细胞分组如下：对照组为正常培养的AR42J细胞；模型组按照1.2.1 建模方法处理AR42J 细胞；模型+anti-miR-NC 组、模型+anti-miR-141-3p 组、模型+pcDNA 组、模型+pcDNACUEDC2组为利用Lipofectamine 2000分别转染antimiR-NC、anti-miR-141-3p、pcDNA、pcDNA-CUEDC2至AR42J 细胞后，按照1.2.1 建模方法处理AR42J 细胞。随后分别收集细胞和细胞上清液，检测细胞凋亡以及TNF-α和IL-6的分泌情况。

1.2.3 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测 收集对照组、模型组以及转染48 h 的AR42J 细胞，分别按照TRIZOL 试剂说明书提取细胞中的总RNA，使用cDNA 第一链合成试剂盒反转录合成cDNA，以GAPDH作为参照，采用qRT-PCR检测CUEDC2 信使RNA（mRNA）的表达水平。使用一步法miRNA反转录试剂盒合成cDNA，以U6 为模板，采用qRTPCR 检测miR-141-3p 的表达水平。PCR 反应体系为20 μL：包括SYBR Premix Ex Taq 10 μL、上游引物0.5 μL 和下游引物0.5 μL，cDNA 2 μL，RNase Free 水（RNase Free H2O）7 μL。采用2-ΔΔCt法分析CUEDC2 mRNA 和miR-141-3p的表达水平。引物序列（5’-3’）如下：miR-141-3p 正向ACACTCCAGCTGGGCATCTTCCAG，反向 AATTCAGTTGAGTCCAAC；CUEDC2正向GATGCCAGGAACAAAGAGAA，反向CTCATCTTGGGTGTCTGC；GAPDH 正 向GAAGGTGAAGGTCGGAGTC，反 向GAAGATGGTGATGGGATTTC；U6正向ATTGGAACGATACAGAGAAGATT，反向GGAACGCTTCACGAATTTG。

1.2.4 双荧光素酶报告基因实验 生物信息学软件starbase 预测显示miR-141-3p 和CUEDC2 的3’-UTR存在互补结合位点。将CUEDC2的互补结合位点进行突变，采用双荧光素酶报告基因实验验证miR-141-3p 和CUEDC2 的靶向关系。将WT-CUEDC2 和MUT-CUEDC2 分别与miR-141-3p 模拟物（miR-141-3p mimics）或miR 模拟物阴性对照（miR-NC）共转染AR42J细胞，培养48 h，用荧光素酶活性检测试剂盒测定荧光素酶活性变化。

1.2.5 流式细胞术检测细胞凋亡率 采用膜联蛋白V（Annexin V）-异硫氰酸荧光素（FITC）/碘化丙锭（PI）试剂盒检测细胞凋亡。将AR42J细胞按照每孔1×106个细胞的密度接种于6 孔板，24 h 后，弃去培养基，每孔细胞采用加入100 nm/L 的雨蛙素处理6 h，采用预冷的磷酸盐缓冲液洗涤细胞两次，800 rpm离心5 min，随后用预冷的1×结合缓冲液重悬细胞，调整细胞密度为1×106/mL，取100 μL 细胞悬液，加入5 μL 的Annexin V-FITC 混匀，在加入5 μL 的PI染色，室温避光孵育15 min，补加1×结合缓冲液至500 μL后进行上机检测。

1.2.6 蛋白质印迹法（Western blotting）检测、CUEDC2、Bcl-2和Bax蛋白的表达 采用RIPA裂解液裂解各组细胞，提取细胞总蛋白。按照BCA 试剂盒说明书测定蛋白浓度，取适量细胞蛋白和等体积1×上样缓冲液混匀，煮沸变性后冷却至室温备用。取30 μg 蛋白样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳结束后将细胞蛋白转移至聚偏二氟乙烯膜，5%脱脂牛奶室温封闭1 h 后，洗膜后分别加入Ⅰ抗CUEDC2 抗体（1∶1 000）、Bcl-2 抗体（1∶1 000）、Bax抗体（1∶1 000）和GAPDH 抗体（1∶1 000）室温孵育2 h，洗膜后加入相对应Ⅱ抗室温避光孵育1 h，洗膜后进行化学发光显色，以GAPDH 为参照，分析各目的条带的灰度值。

1.2.7 Elisa 法检测TNF-α 和IL-6 的表达水平 将AR42J 细胞按照每孔1×106个细胞的密度接种于6孔板，24 h 后，弃去培养基，用100 nm/L 的雨蛙素诱导AR42J 细胞6 h，收集细胞上清液，按照TNF-α 和IL-6 Elisa检测试剂盒步骤测定细胞上清液中TNF-α和IL-6的表达水平。

1.3 统计学方法本研究所有数据均用SPSS 21.0软件统计分析，数据以表示，两组数据间比较采用独立样本t检验；多组间比较用单因素方差，进一步组内两两比较用采用SNK-q检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-141-3p 和CUEDC2 在雨蛙素诱导的大鼠胰腺腺泡细胞中的表达与对照组比较，模型组AR42J 细胞中miR-141-3p 的表达水平显著升高，CUEDC2 mRNA 和CUEDC2 蛋白的表达水平显著降低（P＜0.05）。见图1、表1。

图1 CUEDC2蛋白在雨蛙素诱导的大鼠胰腺腺泡细胞中的表达

表1 miR-141-3p和CUEDC2在雨蛙素诱导的大鼠胰腺腺泡细胞中的表达/

表1 miR-141-3p和CUEDC2在雨蛙素诱导的大鼠胰腺腺泡细胞中的表达/

注：miR-141-3p 为微小RNA-141-3p，CUEDC2 为含CUE 结构域蛋白2，mRNA为信使RNA。

2.2 miR-141-3p 靶向调控CUEDC2 的表达starbase 预测显示，miR-141-3p 和CUEDC2 的3’-UTR存在部分特异性结合位点。miR-141-3p mimics和WT-CUEDC2 共转染组AR42J 细胞的荧光素酶活性较miR-NC 和WT-CUEDC2 共转染组显著降低（P＜0.05），而miR-141-3p mimics 和MUT-CUEDC2共转染组AR42J 细胞的荧光素酶活性较miR-NC 和MUT-CUEDC2 共转染组变化无统计学意义。转染miR-141-3p mimics 后AR42J 细胞CUEDC2 蛋白的表达水平显著降低；转染anti-miR-141-3p 后AR42J细胞CUEDC2 蛋白的表达水平显著升高（P＜0.05）。miR-141-3p 靶向负性调控CUEDC2 表达。见表2、表3、图2。

图2 miR-141-3p靶向调控CUEDC2的表达：A为CUEDC2的3’UTR中含有与miR-141-3p互补的核苷酸序列；B为CUEDC2蛋白表达

表2 双荧光素酶报告实验/

表2 双荧光素酶报告实验/

注：miR-NC 为miR 模拟物阴性对照，miR-141-3p 为微小RNA-141-3p，WT-CUEDC2 为野生型含CUE 结构域蛋白2，MUT-CUEDC2为突变型含CUE结构域蛋白2。

表3 miR-141-3p调控CUEDC2蛋白的表达/

表3 miR-141-3p调控CUEDC2蛋白的表达/

注：miR-NC 为miR 模拟物阴性对照，miR-141-3p 为微小RNA-141-3p，anti-miR-NC 为miR抑制物阴性对照，anti-miR-141-3p 为miR-141-3p抑制物，CUEDC2为含CUE结构域蛋白2。①与miR-NC组比较，P＜0.05。②与anti-miR-NC组比较，P＜0.05。

2.3 抑制miR-141-3p 表达对雨蛙素诱导的大鼠胰腺腺泡细胞损伤的影响与对照组比较，模型组AR42J 细胞miR-141-3p 的表达水平显著增加，细胞凋亡率显著升高，Bax 蛋白的表达水平显著升高，Bcl-2 蛋白的表达显著降低，炎性因子TNF-α 和IL-6分泌显著增加；与模型+anti-miR-NC 组比较，转染模型+anti-miR-141-3p 组AR42J 细胞miR-141-3p 的表达水平显著降低，细胞凋亡率显著，Bax蛋白的表达水平显著升高，Bcl-2蛋白的表达显著降低，炎性因子TNF-α和IL-6分泌显著降低（P＜0.05）。见表4、图3。

表4 抑制miR-141-3p表达对雨蛙素诱导的大鼠胰腺腺泡细胞损伤的影响/

表4 抑制miR-141-3p表达对雨蛙素诱导的大鼠胰腺腺泡细胞损伤的影响/

注：anti-miR-NC 为miR 抑制物阴性对照，anti-miR-141-3p 为miR-141-3p 抑制物，miR-141-3p 为微小RNA-141-3p，Bcl-2 为B 细胞淋巴瘤/白血病-2，Bax为Bcl-2相关X蛋白，TNF-α为肿瘤坏死因子α，IL-6为白细胞介素-6。①与对照组比较，P＜0.05。②与模型组+anti-miR-NC组比较，P＜0.05。

图3 抑制miR-141-3p表达对雨蛙素诱导的大鼠胰腺腺泡细胞凋亡的影响：A为凋亡相关蛋白表达；B为细胞凋亡流式细胞术图

2.4 CUEDC2 过表达对雨蛙素诱导的大鼠胰腺腺泡细胞损伤的影响与对照组比较，模型组AR42J细胞CUEDC2 的表达水平显著降低，细胞凋亡率显著升高，Bax蛋白的表达水平显著升高，Bcl-2蛋白的表达显著降低，炎性因子TNF-α 和IL-6 分泌显著增加；与模型+pcDNA 组比较，模型+pcDNA-CUEDC2组AR42J 细胞CUEDC2 的表达水平显著升高，细胞凋亡率显著升高，Bax 蛋白的表达水平显著升高，Bcl-2 蛋白的表达显著降低，炎性因子TNF-α 和IL-6分泌显著降低（P＜0.05）。见表5、图4。

表5 CUEDC2过表达对雨蛙素诱导的大鼠胰腺腺泡细胞损伤的影响/

表5 CUEDC2过表达对雨蛙素诱导的大鼠胰腺腺泡细胞损伤的影响/

注：pcDNA 为空载体，pcDNA-CUEDC2 为CUEDC2 过表达载体，CUEDC2 为含CUE 结构域蛋白2，Bcl-2 为B 细胞淋巴瘤/白血病-2，Bax 为Bcl-2相关X蛋白，TNF-α为肿瘤坏死因子α，IL-6为白细胞介素-6。①与对照组比较，P＜0.05。②与模型组+pcDNA组比较，P＜0.05。

图4 CUEDC2过表达对雨蛙素诱导的大鼠胰腺腺泡细胞中CUEDC2和凋亡相关蛋白表达的影响

2.5 抑制CUEDC2表达逆转了抑制miR-141-3p表达对雨蛙素诱导的大鼠胰腺腺泡细胞损伤的保护作用与模型+anti-miR-NC 组比较，转染模型+antimiR-141-3p 组AR42J 细胞CUEDC2 和Bax 蛋白的 表达水平显著升高，细胞凋亡率显著升高，Bcl-2蛋白的表达显著降低，炎性因子TNF-α 和IL-6 分泌显著降低；与模型+anti-miR-141-3p+si-NC 组比较，模型组+anti-miR-141-3p+si-CUEDC2 组AR42J 细 胞CUEDC2和Bax蛋白的表达水平显著降低，细胞凋亡率显著降低，Bcl-2蛋白的表达水平显著升高，炎性因子TNF-α和IL-6分泌显著升高（P＜0.05）。见表6、图5。

表6 抑制CUEDC2表达逆转了抑制miR-141-3p表达对雨蛙素诱导的大鼠胰腺腺泡细胞损伤的作用/

表6 抑制CUEDC2表达逆转了抑制miR-141-3p表达对雨蛙素诱导的大鼠胰腺腺泡细胞损伤的作用/

注：anti-miR-NC 为miR 抑制物阴性对照，anti-miR-141-3p为miR-141-3p抑制物，anti-miR-141-3p+si-NC 为miR-141-3p抑制物+小干扰RNA对照，anti-miR-141-3p+si-CUEDC2 为miR-141-3p 抑制物+CUEDC2 小干扰RNA，miR-141-3p 为微小RNA-141-3p，CUEDC2 为含CUE 结构域蛋白2，Bcl-2为B细胞淋巴瘤/白血病-2，Bax为Bcl-2相关X蛋白，TNF-α为肿瘤坏死因子α，IL-6为白细胞介素-6。①与CAE+anti-miR-NC组比较，P＜0.05。②与CAE+anti-miR-141-3p+si-NC组比较，P＜0.05。

图5 抑制CUEDC2表达逆转了抑制miR-141-3p表达对雨蛙素诱导的大鼠胰腺腺泡细胞中CUEDC2和凋亡相关蛋白表达的作用

3 讨论

急性胰腺炎是一种常见的急腹症，发病率逐渐增高，常伴有组织器官功能障碍，难以治愈。胰腺腺泡细胞凋亡作为一种自我保护机制［8］，在急性胰腺炎的临床结局中发挥重要作用。因此，探索腺泡细胞凋亡的机制具有重要意义。

miRNAs 在调节机体发育、细胞增殖和凋亡、器官形成、多种疾病的发生发展等多种生物学活动中发挥着重要的作用［9-10］。miR-141-3p 是一种多功能miRNA，在缺氧诱导的H9c2 细胞中miR-141-3p 的表达显著增加，抑制miR-141-3p 可通过激活RP105依赖性磷酸肌醇3激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol-3-kinase/Protein kinase，PI3K/AKT）信号通路来降低缺氧诱导的H9c2 心肌细胞凋亡［11］；同时，miR-141-3p 通过调控靶基因表达在骨肉瘤细胞［12］、神经胶质瘤细胞［13］的凋亡中发挥重要作用；此外，miR-141-3p 还与实验性自身免疫性心肌炎［14］和糖尿病肾病［15］的炎性损伤有关。然而，miR-141-3p 在急性胰腺炎中的分子机制尚不清楚。本研究采用雨蛙素刺激大鼠胰腺腺泡细胞AR42J 构建急性胰腺炎细胞模型，结果显示雨蛙素诱导后AR42J 细胞miR-141-3p 的表达水平显著升高，与Lu 等［4］miR-141-3p在急性胰腺炎病人血清中表达上调结论相吻合。抑制miR-141-3p表达后AR42J细胞Bax的表达水平显著升高，Bcl-2 的表达水平显著降低，细胞凋亡率显著增加。TNF-α可以增加趋化因子和粘附因子的表达和促进因子IL-6 的分泌，导致炎症反应加剧，胰腺损伤进一步恶化。IL-6 还能促进T 细胞和B 细胞的增殖，释放多种炎性因子。本研究结果显示，抑制miR-141-3p表达后细胞上清液中TNF-α和IL-6的表达水平显著降低，提示miR-141-3p 通过调节胰腺腺泡细胞的凋亡和抑制细胞的炎症反应来减轻急性胰腺损伤。

CUEDC2 是由约40 个氨基酸组成的小而保守的泛素结合域蛋白，在真核生物体内广泛存在，与多种肿瘤发生和炎症反应密切相关［16］。高水平的CUEDC2 可能导致促后期复合物或环体早期失活，最终导致染色体错聚和非整倍性，进而促进肿瘤形成［17］。CUEDC2 还可抑制多种促炎因子表达，减少间质胶原沉积，减轻肾脏纤维化［18］。此外，高表达CUEDC2 可减轻结肠炎症反应，显著地抑制核因子κB（NF-κB）和Janus 蛋白酪氨酸激酶（janus protein tyrosine kinase，JAK）/信号转导和转录激活因子（signal transducer and activator of transcription，STAT）信号传导途径的激活，预防结肠炎的发生［19］。本研究结果显示，急性胰腺炎细胞模型中CUEDC2 的表达水平显著降低，miR-141-3p 可靶向负性调控CUEDC2 表达。此外，过表达CUEDC2 后AR42J 细胞凋亡率显著增加，TNF-α 和IL-6 的表达水平显著降低，与前人的研究结论相一致［5-6］。抑制CUEDC2表达逆转了抑制miR-141-3p 表达对雨蛙素诱导的大鼠胰腺腺泡细胞凋亡和炎症反应的影响。以上结果提示，miR-141-3p 通过调控CUEDC2 表达参与急性胰腺炎腺泡细胞的凋亡可炎症反应。

综上，抑制miR-141-3p 通过靶向CUEDC2 诱导胰腺腺泡细胞凋亡，抑制炎症反应，进而在轻急性胰腺炎中发挥保护作用。然而，miR-141-3p 在急性胰腺炎中的作用需要在动物模型中进一步验证。