五味子降酶胶囊质量控制研究

2022-04-04任路路姚大洋任莹李小伟

安徽医药 2022年4期

任路路，姚大洋，任莹，李小伟

慢性肝炎在我国发病率高并呈上升趋势，其活动期往往伴随ALT（谷丙转氨酶）、AST（谷草转氨酶）、TBiL（总胆红素）等指标的升高。中医认为，慢性肝病的病因往往是正气不足、饮食不节，以致损伤脾胃，脾胃不能化湿，则湿热内生，因脾伤肝，造成肝胆脾胃不和，从而加剧了正气的损伤，导致肝炎的发生；另外，正气不足，极易感染疫毒。古人云：邪之所干，其气必虚。说明本证是本虚标实证。我院肝病科老中医经过多年临床摸索，认为慢性肝病病人正气虚为本，外感或内生湿热为标，治疗上要攻补兼施。五味子降酶胶囊正是在此基础上研制而出，其由五味子、女贞子、板蓝根、败酱草四味药组成，具有补益肝肾、清热解毒、凉血止痛的功效；用于肝胆湿热型胁痛、积聚证，症见乏力、纳差、腹胀、胁肋部疼痛等。方中五味子性温，味酸、甘，具有收敛固涩、益气生津、补肾宁心的功效，现代药理研究表明五味子具有保肝降酶的作用，是多种保肝药的主要成分，为君药［1-2］；女贞子味甘苦性凉，具有补益肝肾、清虚热、明目的功效，与五味子合用，增强其补益肝肾的作用，为臣药；板蓝根味苦性寒，具有清热解毒、凉血的功效；败酱草味辛、苦，具有清热解毒、消肿排脓、活血止痛的功效，与板蓝根辅助起到清肝胆祛湿热的作用，故二药为佐药。四药合用，攻补兼施，攻邪不伤正，扶正不留邪。五味子降酶胶囊在我院临床运用多年，效果显著。为了更好地控制制剂质量，保证临床疗效，特对处方中各药味进行研究，以建立质量标准，严把制剂质量。

1 仪器与试药

1.1 仪器U-3000 型高效液相色谱仪（赛默飞）；FA2004型电子天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）；ZF-2 型三用紫外仪（上海安亭电子仪器厂）；KQ-300DE 型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；HH 型数显恒温水浴锅（常州国宇仪器制造有限公司）；DHG-9055A 型鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）。

1.2 试药五味子对照药材（中国食品药品检定研究院，批号120922-201309）；五味子醇甲对照品（中国食品药品检定研究院，批号110857-201513）；精氨酸对照品（中国食品药品检定研究院，批号140685-201707）；五味子降酶胶囊（太和县中医院，批号20190621、20190623、20190625）；五味子（亳州市沪谯药业有限公司，批号1902220328），女贞子（亳州市沪谯药业有限公司，批号1901120124），板蓝根（亳州市沪谯药业有限公司，批号1904250252），败酱草（亳州市沪谯药业有限公司，批号1903210211），以上饮片经我院副主任中药师王虎鉴定均为正品；甲醇（SccBayer，色谱纯）；水为娃哈哈纯净水；其余试剂均为分析纯。

2 薄层鉴别

2.1 五味子的薄层鉴别［3］取五味子降酶胶囊的内容物1 g，加三氯甲烷20 mL，加热回流30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加1 mL三氯甲烷使溶解，作为供试品溶液；另取按处方比例及生产工艺制成的不含五味子的五味子降酶胶囊，按上述方法制成阴性对照溶液；再取五味子对照药材1 g，同法制成对照药材溶液；再另取五味子醇甲对照品，加甲醇溶解，制成每1毫升含五味子醇甲1 mg的溶液作为对照品溶液。照薄层色谱法（中国药典2015 年版四部通则0502）试验，分别吸取上述四种溶液各5 μL，点于同一硅胶GF254薄层板上，以石油醚（30～60 ℃）-甲酸乙酯-甲酸（15∶5∶1）的上层溶液为展开剂，上行展开，距薄层板上沿1 cm 时取出，晾干，置三用紫外仪（254 nm）下检视。供试品色谱中，在与对照品和对照药材色谱相应Rf 位置处，显相同颜色的斑点；而阴性样品在此位置处无斑点。说明该方法专属性强，可作为该制剂中五味子的鉴别方法。

2.2 板蓝根的薄层鉴别［4］取五味子降酶胶囊的内容物1.75 g，加水60 mL，加热回流1 h，滤过，滤液上钠型732 型阳离子交换树脂（柱长10 cm，内径1.5 cm），水洗至洗液呈中性，再用2 mol/L 的氨水溶液150 mL 洗脱，弃去前50 mL 洗脱液，收集后100 mL洗脱液，蒸干，残渣加稀乙醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。另取按处方比例及生产工艺制成的不含板蓝根的五味子降酶胶囊，按上述方法制成阴性对照溶液；再取板蓝根对照药材1 g，同法制成对照药材溶液；再另取精氨酸对照品，加甲醇溶解，制成每1 毫升含精氨酸0.5 mg 的溶液作为对照品溶液。照薄层色谱法（中国药典2015 年版四部通则0502）试验，分别吸取上述四种溶液各5 μL，点于同一硅胶G薄层板上，以无水乙醇-氨水（3∶2）为展开剂，上行展开，距薄层板上沿1 cm 时取出，晾干。喷以茚三酮试液，置105 ℃鼓风干燥箱中加热到斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品和对照药材色谱相应Rf位置处，显相同颜色的斑点；而阴性样品在此位置处无斑点。说明该方法专属性强，可作为该制剂中板蓝根的鉴别方法。

3 含量测定（中国药典2015年版四部通则0512试验）

3.1 波长的选择用甲醇为空白试剂，在200～400 nm 范围内对五味子醇甲进行波长扫描。结果显示，五味子醇甲在216 nm、251 nm 附近有最大吸收。同时参考药典及文献中“五味子醇甲”的含量测定方法，确定本品的测定波长为250 nm。

3.2 色谱条件及系统适用性试验［5-9］色谱柱用ODS 柱（依利特，Hypersil ODS2 5 μm 4.6×250 mm）；流动相为甲醇-水（65∶35）；流速为1 mL/min；柱温设30 ℃；检测波长为250 nm。理论板数以五味子醇甲峰计算应不低于2 000。进样量为5 μL。

3.3 溶液的制备

3.3.1 对照品溶液的制备精密称取五味子醇甲对照品适量，加甲醇制成每1 毫升含30 μg 的溶液，即得。

3.3.2 供试品溶液的制备［10-12］精密称取混匀的装量差异项下的本品内容物0.75 g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，称定重量，超声处理（功率250 W，频率20 kHz）20 min，取出，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密移取5 mL 续滤液至10 mL 容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得。

3.4 专属性试验取缺五味子的五味子降酶胶囊，按“3.3.2”方法制成阴性样品溶液。精密吸取对照品、供试品及阴性样品三种溶液各5 μL，按“3.2”条件进样，记录色谱图。见图1。

结果可见，供试品的色谱图中，在与五味子醇甲峰相同保留时间处显相同的色谱峰；而阴性样品在此时间处无色谱峰。阴性无干扰，方法专属性强。

3.5 线性关系考察［13-15］精密称取五味子醇甲对照品适量，加甲醇溶解，制成浓度为0.333 7 g/L的对照品溶液作为储备液。精密移取1 mL储备液至10 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，制成浓度为0.033 37 g/L 溶液作为工作液。按“3.2”条件，分别精密吸取工作液1 μL、2 μL、4 μL、8 μL、12 μL、16 μL 进样，记录峰面积。以五味子醇甲的进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，得回归方程y=35.486x+0.174 6，r=0.999 5。由此说明，五味子醇甲在0.033 37～0.533 92 μg 范围内与峰面积呈较好的线性关系。

3.6 精密度考察精密吸取“3.5”中的工作液5 μL，在“3.2”条件下连续进样测定6次，记录峰面积。结果五味子醇甲的平均峰面积6.127 0，相对标准差（RSD）=0.16%，说明仪器具有较好的精密度。

3.7 重复性试验精密称取五味子降酶胶囊（批号20190621）内容物0.75 g，共6份，分别制成供试品溶液，在“3.2”条件下进样并计算含量。结果6 份样品的平均含量为2.40 mg/g，RSD=0.32%，说明该方法重复性较好。

3.8 样品稳定性试验精密称取五味子降酶胶囊（批号20190621）内容物0.75 g 制成供试品溶液，分别于制成后0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h进样，测定峰面积。结果平均峰面积6.719 8、RSD=0.44%。由此可知，样品室温条件下24 h内基本稳定。

3.9 加样回收试验［16］精密称取已知含量的五味子降酶胶囊6 份（每份约0.40 g），精密加入“3.5”项下的储备液2.5 mL，按上述方法及色谱条件进行测定，计算回收率，结果见表1。由表1可知，样品平均回收率为100.07%，RSD=0.57%。说明该方法准确度较高。

表1 回收率测定结果

3.10 样品含量测定取连续3 批的五味子降酶胶囊，按所述的样品处理方法及色谱条件进样测定，计算五味子醇甲的含量，批号20190621、20190623、20190625 的制剂含量每粒分别为0.84 mg、0.85 mg、0.85 mg。

4 讨论

4.1 含量测定指标成分及薄层鉴别方法的确定五味子主要含五味子醇甲、五味子乙素等成分，根据《中国药典》2015 年版、《中药制剂质量及稳定性研究技术指导原则》首选君药、贵重药、毒性药材制订含量测定项目的要求，故选择君药五味子中五味子醇甲作为HPLC 测定的指标成分；同时用五味子醇甲及五味子对照药材进行TLC 鉴别，结果斑点清晰、专属性强，能清楚地反映五味子的薄层特征。板蓝根化学成分复杂，主要含（R，S）-告依春、靛蓝、精氨酸等化学成分。本研究曾用化学鉴别法鉴别板蓝根中的氨基酸，阴性虽无干扰，但化学鉴别方法简单，特异性差，不足以作为板蓝根的鉴别方法；用TLC 法鉴别板蓝根中的（R，S）-告依春，阴性亦有干扰，专属性不强［17］；靛蓝的含量较低，TLC 鉴别斑点不清晰，不易检出；而精氨酸经过钠型732型阳离子交换树脂处理，再用氨水溶液洗脱提纯后，分离效果好，专属性强，斑点显色清晰，故可作为本制剂中板蓝根的鉴别方法。败酱草收载于地方炮制规范中，主要含齐墩果酸、败酱烯等化学成分，本研究曾用TLC 法鉴别处方中的败酱草［18］，但阴性干扰明显，专属性不强。女贞子亦含有齐墩果酸，与败酱草相互干扰，同时含有女贞苷、特女贞苷等化学成分，由于工艺及处方量的影响，用TLC 法鉴别女贞子中特女贞苷，斑点不清晰、分离效果差且阴性有微弱的干扰［19］。根据《中药制剂质量及稳定性研究技术指导原则》鉴别项的要求“对主要药味进行研究，选择专属性强、灵敏度高、重现性好、操作简便的鉴别方法纳入标准正文”，故将五味子、板蓝根的薄层鉴别方法收入质量标准，女贞子、败酱草的薄层鉴别尚需进一步研究。

4.2 含量测定提取方法及溶剂的选择药典及文献［20-21］中五味子醇甲的提取有超声法及加热回流法两种。本研究曾考察了两种提取方法五味子醇甲的含量高低，发现超声提取含量略高但不明显。综合考虑操作的简易程度及能源消耗，故本试验选择超声法作为HPLC 的提取方法。溶剂选择方面，本研究比较了分别用甲醇、乙醇、50%甲醇超声后五味子醇甲的含量高低，发现三种溶剂处理的色谱峰分离度及不对称性均较好，色谱图差别不明显；而甲醇处理五味子醇甲的含量最高，故选择甲醇作为五味子醇甲的提取溶剂。

4.3 含量限度的确定受工艺及生产实际的影响，制剂含量往往较投料的理论含量下降明显。而制成制剂后，饮片指标成分含量进入制剂的比率称为转移率。本制剂五味子粉碎入药，有效成分损耗较少。研究测定了五味子降酶胶囊及投料的五味子的含量，计算平均转移率为75.59%。由处方计算，本制剂每粒含五味子饮片0.14 g，根据《中国药典》2015 年版“五味子”的含量限度，并结合转移率及工业化生产实际，暂定本制剂的含量限度为不低于每粒0.40 mg。由于含量测定批次有限，故转移率及制剂含量限度尚需进一步考察。