孕晚期阴道定植B 族链球菌的血清型和基因分型与新生儿感染的关系

罗 勇，彭新平，龙运峰，黄 佳，刘 瑾

（邵阳学院附属第一医院新生儿重症监护科，湖南 邵阳 422000）

B 族链球菌(group B streptococcus，GBS)是一种主要定植于肠道、阴道的革兰阳性球菌，妊娠女性定植率为10%～35%，比非妊娠女性高出20 倍[1]。孕晚期女性感染GBS 可引发流产、产褥感染、子宫内膜炎、胎膜早破、早产等不良妊娠结局；且GBS 可通过羊水、胎盘或分娩时由产道传给新生儿，可使新生儿发生早发型GBS 感染性疾病（early-onset GBS disease，GBS-EOD），如脑膜炎、败血症、肺炎等严重疾病[2]。研究发现，孕妇感染GBS 血清型和基因分型存在种族及地区差异，且不同血清型、基因分型对新生儿GBS-EOD 的致病力有差异，对新生儿的危害程度也不同[3]。目前，孕晚期女性阴道定植GBS 血清型和基因分型与新生儿感染的关系报道较少，基于此，本研究通过确定孕晚期女性GBS 血清型、基因分型，分析两者与新生儿GBS-EOD 发生的相关性，以期为临床防治GBS 感染提供依据。

1 研究对象与方法

1.1 研究对象

选取2016 年1 月至2020 年9 月于邵阳学院附属第一医院孕检、分娩的1 945 例妊娠女性作为研究对象，年龄23～39 岁，平均年龄（31.64±6.70）岁；孕周35～37 周，平均孕周为（36.05±0.82）周。纳入标准：①孕周为35～37 周；②单胎妊娠；③2 周内未使用抗生素；④临床资料齐全。排除标准：①产前已明确诊断孕有畸形胎儿需引产的女性；②合并高血压、慢性肾炎、糖尿病、急性感染、生殖器畸形等妊娠女性；③习惯性流产者。

1 945 例妊娠女性分娩的活产新生儿中有25 例发生GBS 垂直传播，罹患新生儿GBS-EOD，其中男13 例，女12 例；胎龄37～41 周，平均胎龄为（38.42±1.23）周；日龄1～14.3h，平均日龄为（7.93±4.77）h；出生体重2 026.5～4 158.4g，平均出生体重为（3 138.53±778.92）g。新生儿GBS-EOD 诊断标准：参考邵肖梅等主编的《实用新生儿学》中新生儿GBS-EOD（脑膜炎、败血症、肺炎）有关判定标准[4]。纳入标准：①符合GBS-EOD 诊断标准，无菌体液（血液、气管内痰液、脑脊液）培养GBS，呈阳性；②具备完整的临床资料。排除标准：①未见临床感染症状，仅体表分泌物或气管内痰液GBS 培养呈阳性的新生儿；②合并遗传代谢疾病的新生儿。

孕妇或亲属均已签署知情同意书，研究符合《赫尔辛基宣言》，经本院伦理委员会批准。

1.2 研究方法

1.2.1 样本收集

所有妊娠女性于35～37 孕周产前检查时，采集孕妇阴道下段1/3 位置的分泌物及肛门内5cm 处的直肠分泌物，送检。在给予GBS-EOD 患儿使用抗生素治疗前，收集25 例GBS-EOD 新生儿的血液、气管内痰液、脑脊液标本，送检。

1.2.2 孕妇阴道GBS 培养、鉴定

将收集的直肠及阴道分泌物拭子放入GBS TranSwab 装置塑胶管内，于5%CO2、35℃培养箱中培养24h。根据试管内颜色判断是否存在GBS，若呈胡萝卜色则判断为GBS 阳性；若无颜色变化，则判断为GBS 阴性。将试管内标本转种于胡萝卜素β/γ 乙型链球菌二分格营养琼脂培养基上培养，挑选可疑菌落，鉴定，确定GBS 生长，于-80℃冰箱中保留菌株，备检。

1.2.3 新生儿GBS 培养、鉴定

培养新生儿血液、气管内痰液、脑脊液标本，使用PHOENIX100 细菌鉴定系统鉴定菌株。鉴定后分离出GBS 菌株，保留于-80℃冰箱中，备检。

1.2.4 GBS 菌株复苏

将GBS 菌株复苏，接种于M-H 血平板上，之后，置于5%CO2、35℃培养箱中培养，过夜。

1.2.5 GBS 血清型鉴定

利用血清分型试剂盒按乳胶凝集法确定GBS 菌株的血清型，若GBS 菌株不与Ⅰa、Ⅰb、Ⅱ～Ⅹ等10种乳胶凝集分型试剂发生凝集，则将其血清型定义为不可分（non-typeable，NT）型，具体操作及判断方法参考文献[5]。

1.2.6 GBS 基因分型鉴定

利用PCR 扩增技术对GBS 阳性样本进行扩增，反应结束后，将PCR 扩增产物送到上海生工有限公司，进行多位点序列分型（multilocus sequence typing，MLST）鉴定，比对测序结果。

1.3 统计学方法

采用SPSS 22.0 软件分析处理数据，对血清型分布、基因分型等计数资料均以例数和百分数[n（%）]描述，行Fisher 确切概率法。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 孕妇阴道GBS 定植情况

对1 945 例孕晚期女性进行GBS 筛查，共检出GBS 阳性孕妇234 例，GBS 定植率为12.03%。

2.2 孕妇阴道定植GBS 的血清型分布

234 例孕晚期女性阴道定植GBS 共检出7 个血清型，主要血清型是Ⅲ型（52.14%）和Ⅰb 型（21.37%），其次是Ⅴ型（10.26%）和Ⅰa 型（9.83%），最后是Ⅱ型（4.70%）、NT 型（1.28%）及Ⅵ型（0.43%），见表1。

表1 孕妇阴道定植GBS 的血清型分布[n（%）]Table 1 Distribution of vaginal colonized GBS serotypes in pregnant women[n(%)]

2.3 GBS 血清型与新生儿GBS-EOD 的关系

25 例新生儿GBS-EOD 共发现5 种GBS 血清型，不同血清型引起的新生儿GBS-EOD 发生率差异无统计学意义（P＞0.05）。发病率由高到低排列依次为Ⅲ型56.00%（14/25）、Ⅰa 型24.00%（6/25）、Ⅰb 型8.00%（2/25）、Ⅱ型8.00%（2/25）、Ⅴ型4.00%（1/25）。NT、Ⅵ型GBS 未引起GBS-EOD；且Ⅲ型GBS 引起的新生儿脑膜炎、败血症、肺炎占比最高，分别为100.00%（3/3）、45.45%（5/11）、54.55%（6/11），见表2。

表2 孕妇阴道定植GBS 血清型与新生儿GBS-EOD 发生的关系[n（%）]Table 2 The relationship between vaginal colonized GBS serotypes in pregnant women and the occurrence of GBS-EOD in newborns[n(%)]

2.4 分娩GBS-EOD 患儿的孕妇阴道定植GBS的MLST 分型结果

对25 例GBS-EOD 患儿对应的孕晚期女性阴道定植GBS 进行MLST 分型，结果显示，共鉴定出8 种基因型，排名前3 位的分别是ST19 型（36.00%）、ST17 型（28.00%）、ST12 型（16.00%），见表3。

表3 分娩GBS-EOD 患儿的孕妇阴道定植GBS 的MLST 分型结果[n（%）]Table 3 MLST classification results of vaginal colonized GBS in pregnant women delivered infants with GBS-EOD[n(%)]

2.5 分娩GBS-EOD 患儿的孕妇阴道定植GBS的MLST 分型与新生儿GBS-EOD 的关系

不同GBS 的MLST 分型引起的新生儿GBSEOD 发病率差异无统计学意义（P＞0.05）。ST19型GBS 在新生儿脑膜炎、肺炎中占比最高，分别为66.67%（2/3）、54.55%（6/11）；ST17、ST12 型在新生儿败血症中占比较高，分别为36.36%（4/11）、27.27%（3/11），见表4。

表4 分娩GBS-EOD 患儿的孕妇阴道定植GBS 的MLST 分型与新生儿GBS-EOD 发生的关系[n（%）]Table 4 Relationship between MLST classification of vaginal colonized GBS in pregnant women delivered infants with GBSEOD and the occurrence of neonatal GBS-EOD [n(%)]

3 讨论

3.1 孕妇阴道GBS 定植率

GBS 是一种β 溶血的厌氧菌，是导致围产期母婴感染的条件致病菌，可造成新生儿GBS-EOD，具有病死率、患病率高的特点，严重危及母婴健康[6]。此外，GBS 血清型及基因分型与新生儿GBS-EOD 有关[3]。因此，及时确定本地区GBS 血清型及基因分型，对及时防治GBS 感染、改善母婴结局有积极意义。本研究显示，1 945 例孕晚期女性GBS 定植率为12.03%，略高于杨梦楠等[7]检测孕晚期女性GBS 的定植率（11.7%），可能与地区不同相关，提示GBS 在本地区孕晚期女性中有一定定植，应对该地区妊娠女性进行GBS 筛查。

3.2 孕妇阴道定植GBS 的血清型分布

GBS 的抗原结构包含特异性碳水化合物抗原、核蛋白抗原、特异性荚膜多糖抗原，按特异性荚膜多糖抗原不同可将GBS 分为Ⅰa、Ⅰb、Ⅱ～Ⅹ等10 种血清型，但有些GBS 无特异性荚膜多糖抗原，无法检测其血清型，为NT 型[8]。不同血清型的GBS 致病能力不同，Ⅲ、Ⅰa 型毒力较强，Ⅲ型感染发病率最高，在孕妇定植和新生儿感染中最为常见（约为50%）[3]。林雅茵等[9]报道显示，厦门市GBS 感染孕妇中检测出8 种血清型，占比较高的前5 位为Ⅲ型（54.2%）、Ⅰb 型（17.7%）、Ⅰa 型（10.0%）、Ⅴ型（9.7%）、Ⅱ型（8.0%），而高爽等[10]研究发现沈阳地区孕晚期女性定植GBS 多以Ⅰa 型（44.22%）、Ⅴ型（38.65%）、Ⅲ型（13.94%）为主要血清型。以上研究表明，不同地区孕晚期女性阴道GBS 血清型有所差异。本研究中孕晚期女性阴道定植GBS 检出7 个血清型，以Ⅲ型（52.14%）、Ⅰb 型（21.37%）、Ⅴ型（10.26%）、Ⅰa型（9.83%）为主，Ⅲ型GBS 占比最高，与林雅茵等[9]研究结果不完全一致，这可能与地区、个体差异、检测时间不同等相关。

3.3 孕妇阴道定植GBS 血清型与新生儿GBSEOD 发生的关系

本研究显示，在25 例GBS-EOD 新生儿中发现5种血清型GBS，Ⅲ型发病率最高（56.00%），其次为Ⅰa 型（24.00%），之后为Ⅰb 型、Ⅱ型、Ⅴ型，与Zhu等[11]研究相似，且NT、Ⅵ型GBS 未见致病，提示Ⅲ、Ⅰa 型GBS 毒力最强，Ⅰb 型、Ⅱ型、Ⅴ型、NT、Ⅵ等血清型的GBS 致病力较弱，确定GBS 血清型可为临床防治新生儿GBS 感染提供有效的指导。另外，本研究中25 例新生儿GBS-EOD 中，新生儿脑膜炎3例（12.00%）、新生儿败血症11 例（44.00%）、肺炎11 例（44.00%），提示新生儿GBS-EOD 多表现为败血症和肺炎。进一步分析发现，GBS-EOD 脑膜炎、败血症、肺炎的GBS 血清型均是以Ⅲ型为主，其中GBS-EOD 脑膜炎的GBS 血清型均是Ⅲ型，提示Ⅲ型GBS 是导致新生儿脑膜炎的最主要血清型。

3.4 分娩GBS-EOD 患儿的孕妇阴道定植GBS的MLST 分型及其与新生儿GBS-EOD 的关系

本研究显示，25 例GBS-EOD 新生儿中鉴定出8种ST 分型的GBS，ST19 型发病率最高，其次为ST17 型，之后为ST12、ST23、ST171、ST456、ST485、ST651 型，且ST19、ST17、ST12 型新生儿GBS-EOD 发生率分别为 36.00%、28.00%、16.00%，提示ST19、ST17、ST12 型GBS 致病力较强，检测GBS 基因分型有利于临床上防治新生儿GBS 感染。而Zhu 等[12]发现ST17 型GBS 在新生儿GBS-EOD 中最为常见，与本研究不一致，可能是选取人群差异造成的，故可通过确定GBS 基因分布特点指导当地临床防治GBS 感染的工作。进一步研究发现，新生儿GBS-EOD 脑膜炎、肺炎均以ST19 型GBS 感染为主，败血症以ST17、ST12 型GBS 感染为主，提示GBS 基因分型可能与GBS 感染的临床表现差异相关，确定当地GBS 基因型分布情况有助于临床防治新生儿GBS-EOD 类疾病，为生产有效疫苗提供参考。

综上所述，孕晚期阴道定植GBS 血清型、基因分型与新生儿GBS-EOD 显著相关，其中以Ⅲ型血清型、ST19 基因型最为常见，且GBS 血清型、基因分型与GBS 感染的不同临床表现密切相关，研究GBS 血清型、基因型分布有利于了解不同血清型、基因型的致病力及流行病学特征，进而探究免疫原性，为针对性制备GBS 疫苗提供依据。但本研究样本数据较小，不能反映国内整体情况，后续仍需扩大样本，为研制有针对性的GBS 疫苗提供依据。