茵陈素调控HIF-1α/BNIP3 通路对高胆红素血症新生大鼠模型神经损伤的保护作用

欧小琴，龚春竹，郑忠梅，秦 彦，曹明慧

（1.电子科技大学医学院附属妇女儿童医院成都市妇女儿童中心医院急诊科；2.内分泌科，四川 成都 611731）

高胆红素血症是常发生于新生儿中的一种全球性疾病，持续的高胆红素水平可损害患儿大脑、小脑、脑干等部位神经功能，造成运动失调、肌张力障碍、智力低下、听力丧失等后遗症，严重影响患儿生长发育，胆红素引发的内质网应激和炎症反应是其主要致病因素[1-2]。细胞在炎症、氧化应激等各种应激因素下可引发自噬，且自噬作用可保护细胞免受损伤，在神经源性疼痛及继发性脑损伤中发挥着重要调控作用，促进自噬可减轻炎症损伤，抑制神经细胞凋亡，发挥神经保护作用[3-4]。低氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）/Bcl2/腺病毒E1B 相互作用蛋白3（Bcl2/adenovirus E1B 19kDa protein-interacting 3，BNIP3）通路是调控细胞存活、凋亡、自噬等过程的重要信号通路，激活HIF-1α/BNIP3 信号可增强细胞自噬，促进其增殖[5]，保护心肌组织免受缺血/再灌注损伤[6]，并可减轻顺铂引起的肾上皮细胞损伤，修复肾功能[7]；另外在创伤性脑损伤中，上调HIF-1α 表达可减少神经细胞凋亡，起到神经保护作用[8]，因而提示HIF-1α/BNIP3 是通过促进自噬抑制胆红素诱导的小脑颗粒神经元凋亡的潜在作用靶点。茵陈素是茵陈、羌活等中药中含有的香豆素类活性成分，具有抗炎作用，可抑制脂多糖诱导的炎症反应，并减轻重症急性胰腺炎引起的相关急性肝损伤[9-10]，但其是否可通过抑制炎症来影响胆红素诱导的小脑颗粒神经元凋亡、自噬，目前还未见明确报道，本研究建立了高胆红素血症新生大鼠模型，对此进行研究。

1 材料与方法

1.1 实验动物

无特定病原体（specific pathogen free，SPF）级SD 大鼠于2020 年5 月中旬购买自济南朋悦实验动物繁育有限公司，生产许可证号：SCXK(鲁)2019 0003，雌雄各半，由本院动物中心饲养，环境温度23℃左右、相对湿度60%左右，并维持清洁、安静、透气，昼夜交替光照（12h/12h），自由饮水饮食。

1.2 主要试剂及仪器

主要试剂有：茵陈素（金锦乐化学有限公司），胆红素（美国Sigma 公司），HIF-1α 抑制剂BAY 87-2243（美国Selleck 生物科技有限公司），TUNEL 染色试剂盒、高效放射免疫沉淀测定（radio-immune precipitation assay，RIPA）裂解液、BCA 试剂盒、OCT 包埋剂（北京索莱宝科技有限公司），大鼠中枢神经特异性蛋白（central nervous system specific protein，S100β）酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒（武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司），大鼠神经元特异性烯醇化酶（neuron-specific enolase，NSE）ELISA 试剂盒（武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司），兔源Anti-GAPDH 抗体、兔源Anti-LC3B 抗体、兔源Anti-Beclin1 抗体、兔源Anti-caspase-3 抗体、鼠源Anti-HIF-1α 抗体、鼠源Anti-BNIP3 抗体（美国Abcam 公司），兔源Bax 一抗、羊抗鼠二抗（美国Cell Singaling Technology 公司）等。

使用仪器：SMZ745 光学显微镜[尼康公司（日本）]，MR-96A 酶标仪[深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司（中国）]，CM1950冰冻切片机-徕卡公司（德国），JS-power600 电泳仪[上海培清科技有限公司（中国）]，Power-pac 3000 转膜仪[伯乐公司（美国）]，Image-Master 凝胶成像分析仪[Applied Biosystems 公司（美国）]等。

1.3 方法

1.3.1 模型制备及分组给药

将雌雄大鼠两两配对合笼，待雌鼠生产后，继续饲养，对7 日龄的新生大鼠腹腔注射胆红素溶液，剂量为100mg/kg[11]，注射1 次，2d 后观察大鼠，发现其皮肤逐渐变黄并加重，出现反应迟钝、转圈、俯伏、肌张力发生障碍、吃奶困难等神经行为学症状，揭示高胆红素血症大鼠模型建立成功（模型大鼠可以进行人工奶粉喂养，保证其生命体征平稳）。模型成功的大鼠随机分为模型组、茵陈素组、BAY87-2243 组、茵陈素+BAY87-2243 组，每组12 只，另取12 只SD 新生大鼠腹腔注射100mg/kg 生理盐水，设为对照组。

参照文献，茵陈素+BAY87-2243 组大鼠以40mg/kg 的剂量腹腔注射茵陈素溶液，同时以4mg/kg的剂量灌胃BAY87-2243 溶液；茵陈素组大鼠以40mg/kg 的剂量腹腔注射茵陈素溶液[12]，同时以4mg/kg 的剂量灌胃生理盐水；BAY87-2243 组大鼠以4mg/kg 的剂量灌胃BAY87-2243 溶液[13]，同时以40mg/kg 的剂量腹腔注射生理盐水；模型组与对照组大鼠均腹腔注射与茵陈素组相同量的生理盐水，同时灌胃与BAY87-2243 组相同量的生理盐水，各组大鼠均于每天上午用药1 次，共用药14 次。

1.3.2 大鼠运动协调及整合能力检测

以横木行走测试[14]检测运动协调及整合能力，用药结束24h 后，使各组大鼠通过一个架起的横木（高50cm，长100cm，直径2.5cm），按照以下标准进行评分：大鼠掉下，不能站立在平衡木上，记0 分；大鼠不能移动，但能站立在平衡木上，记1 分；大鼠能移动，但试图穿过平衡木时掉下，记2 分；大鼠后肢脚滑或失足大于50%的步数，但能穿过平衡木，记3 分；大鼠后肢脚滑或失足小于50%的步数，但能穿过平衡木，记4 分；大鼠后肢脚滑或失足仅出现1 次，但能穿过平衡木，记5分；大鼠穿过平衡木，且无脚滑或失足，记6分。

1.3.3 标本采集和大鼠小脑神经元凋亡情况检测

横木行走测试结束后，统一麻醉各组大鼠，以注射器从腹主动脉吸取血液2mL，离心取上清液，放入-80℃冰箱储存。断头处死大鼠，取出小脑，剪下1g组织放入液氮中保存，剩余组织经磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffered saline，PBS）漂洗、4%多聚甲醛固定后，以30%蔗糖溶液脱水、最佳切削温度复合材料（opti-mum cutting temperature compound，OCT）包埋剂包埋，置于-25℃冰冻切片机中冰冻后切片，取出所得冰冻切片，室温下静置30min，加入3%过氧化氢溶液孵育5min，PBS 漂洗后，参照原位末端标记法[terminal deoxynucleotidyl transferase（TdT）-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL]染色试剂盒说明书的指导步骤进行染色，以30%蔗糖溶液脱水、二甲苯透明后封片，在光学显微镜下任选5 个视野采集图片，测定小脑神经元凋亡率，公式：凋亡率=凋亡神经元/神经元总数×100%。

1.3.4 大鼠血清S100β、NSE 水平检测

将1.3.3 中的血清提前取出，放入4℃冰箱中解冻，参照ELISA 试剂盒说明书的指导步骤检测其中S100β、NSE 水平。

1.3.5 大鼠小脑组织凋亡、自噬及HIF-1α/BNIP3通路相关蛋白表达水平检测

将1.3.3 中的小脑组织取出，剪成小块，加入高效RIPA 裂解液，匀浆，4℃离心，取上清液，参照BCA试剂盒说明书指导步骤测定其中蛋白总浓度，加入上样缓冲液，100℃煮沸5min，待蛋白变性后各取含20μg 总蛋白的样品液，上样后进行电泳、湿转，将转移有分离蛋白的硝酸纤维膜置于5%的牛奶中，室温孵育2h，进行封闭，剪下目的蛋白条带，放入做好标记的孵育小盒中，分别加入兔源caspase-3、Bax、Beclin-1、LC3B、GAPDH 及鼠源HIF-1α、BNIP3 一抗溶液（稀释比分别为：1∶2 000、1∶1 000、1∶5 000、1∶2 000、1∶1 000、1∶2 000、1∶3 000），4℃冰箱中孵育过夜，以TBST 缓冲液洗涤3 次，加入稀释比1:2 000的羊抗兔或鼠二抗溶液，孵育2h，以TBST 缓冲液洗涤3 次，蛋白条带上滴加增强化学发光试剂显色，以凝胶成像分析仪采集图像，并以Tanon 软件分析条带灰度值，并计算各组目的蛋白相对表达量。

1.4 统计学方法

采用软件SPSS 24.0 进行数据分析，计量资料以平均数±标准差（xˉ±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，进一步组间比较行SNK-q检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠横木行走测试结果

各组大鼠横木行走测试得分差异有统计学意义（P＜0.05）。进一步两两比较显示：模型组大鼠横木行走测试得分低于对照组；模型组大鼠横木行走测试得分低于茵陈素组，但高于BAY87-2243 组；茵陈素+BAY87-2243 组大鼠横木行走测试得分低于茵陈素组，但高于BAY87-2243 组，上述差异均有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 各组大鼠横木行走测试得分（xˉ±s，n=12）Table 1 Scores of rats in each group in the beam walking test(xˉ±s,n=12)

2.2 各组大鼠小脑神经元凋亡结果

各组大鼠小脑神经元凋亡率差异有统计学意义（P＜0.05）。进一步两两比较显示：模型组大鼠小脑神经元凋亡率明显高于对照组；模型组大鼠小脑神经元凋亡率高于茵陈素组，低于BAY87-2243 组；茵陈素+BAY87-2243 组大鼠小脑神经元凋亡率高于茵陈素组，低于BAY87-2243 组，上述差异均有统计学意义（P＜0.05），见图1、表2。

图1 TUNEL 染色检测各组大鼠小脑神经元凋亡情况（×200）Fig.1 The apoptosis of cerebellar neurons in each group detected by TUNEL staining(×200)

表2 各组大鼠小脑神经元凋亡率（xˉ±s）Table 2 Apoptosis rate of cerebellar neurons of rats in each group(xˉ±s)

2.3 各组大鼠血清S100β、NSE 水平测定结果

各组大鼠血清S100β、NSE 水平差异均有统计学意义（P＜0.05）。进一步两两比较显示：模型组大鼠血清S100β、NSE 水平明显高于对照组；模型组大鼠血清S100β、NSE 水平高于茵陈素组，低于BAY87-2243 组；茵陈素+BAY87-2243 组大鼠血清S100β、NSE 水平高于茵陈素组，低于BAY87-2243 组，上述差异均有统计学意义（P＜0.05），见表3。

表3 各组大鼠血清S100β、NSE 水平（xˉ±s）Table 3 Serum levels of S100β、NSE of rats in each group(xˉ±s)

2.4 各组大鼠小脑组织凋亡相关蛋白表达结果

各组大鼠小脑caspase-3、Bax 蛋白相对表达水平差异均有统计学意义（P＜0.05）。进一步两两比较显示：模型组大鼠小脑组织caspase-3、Bax 蛋白表达水平明显高于对照组；模型组大鼠小脑组织caspase-3、Bax 蛋白表达水平高于茵陈素组，低于BAY87-2243 组；茵陈素+BAY87-2243 组大鼠小脑组织caspase-3、Bax 蛋白表达水平高于茵陈素组，低于BAY87-2243 组，上述差异均有统计学意义（P＜0.05），见图2、表4。

表4 各组大鼠小脑组织caspase-3、Bax 蛋白相对表达水平（xˉ±s）Table 4 The relative expression levels of caspase-3 and Bax protein in cerebellum of rats in each group(xˉ±s)

图2 免疫印迹检测各组大鼠小脑组织凋亡相关蛋白表达Fig.2 Expression of apoptosis related proteins in rat cerebellum detected by Western blot

2.5 各组大鼠小脑组织自噬及HIF-1α/BNIP3 通路相关蛋白表达结果

各组大鼠小脑组织自噬及HIF-1α/BNIP3 通路相关蛋白表达水平差异均有统计学意义（P＜0.05）。进一步两两比较显示：模型组大鼠小脑组织自噬相关蛋白（Beclin-1、LC3B）及HIF-1α/BNIP3 通路相关蛋白（HIF-1α、BNIP3）表达水平均高于对照组；模型组大鼠小脑组织自噬相关蛋白（Beclin-1、LC3B）及HIF-1α/BNIP3 通路相关蛋白（HIF-1α、BNIP3）表达水平低于茵陈素组，但高于BAY87-2243 组；茵陈素+BAY87-2243 组大鼠小脑组织自噬相关蛋白（Beclin-1、LC3B）及HIF-1α/BNIP3 通路相关蛋白（HIF-1α、BNIP3）表达水平低于茵陈素组，高于BAY87-2243 组，上述差异均有统计学意义（P＜0.05），见图3、表5。

表5 各组大鼠小脑组织自噬及HIF-1α/BNIP3 通路相关蛋白相对表达水平（±s）Table 5 The relative expression levels of autophagy and HIF-1α/BNIP3 pathway related proteins in cerebellum of rats in each group(±s)

表5 各组大鼠小脑组织自噬及HIF-1α/BNIP3 通路相关蛋白相对表达水平（±s）Table 5 The relative expression levels of autophagy and HIF-1α/BNIP3 pathway related proteins in cerebellum of rats in each group(±s)

注：a 与对照组相比，P＜0.05；b 与模型组相比，P＜0.05；c 与茵陈素组相比，P＜0.05；d 与BAY87-2243 组相比，P＜0.05。

组别Beclin-1/GAPDH LC3B/GAPDH HIF-1α/GAPDH BNIP3/GAPDH对照组（n=12）模型组（n=12）0.18±0.04 0.89±0.17a 0.16±0.05 0.91±0.20a 0.15±0.03 0.80±0.16a 0.13±0.04 0.86±0.19a茵陈素组（n=12）BAY87-2243 组（n=12）茵陈素+BAY87-2243 组（n=12）1.64±0.35b 0.20±0.06b 0.90±0.19cd 1.53±0.28b 0.18±0.06b 0.89±0.23cd 1.41±0.30b 0.17±0.05b 0.82±0.18cd 1.52±0.23b 0.14±0.02b 0.85±0.26cd FP 113.717＜0.001 112.062＜0.001 109.716＜0.001 128.531＜0.001

图3 免疫印迹检测各组大鼠小脑组织自噬及HIF-1α/BNIP3 通路相关蛋白表达Fig.3 Expression of autophagy and HIF-1α/BNIP3 pathway related proteins in rat cerebellum detected by Western blot

3 讨论

3.1 高胆红素血症新生大鼠模型的构建

高胆红素血症在新生儿中发病频繁，致死率高，且多数患儿可遗留永久性的神经系统后遗症，明显降低患儿的生活质量，给其家庭带来沉重的精神和经济负担。新生儿发生高胆红素血症时，游离的胆红素沉积于患儿小脑、海马、基底节、脑干等部位，诱导炎症、氧化应激和内质网应激，造成神经细胞变性死亡，引发严重的脑损伤[1-2,15]。NSE 和S100β 蛋白是神经细胞中特有的标记物，广泛分布于大脑、小脑、脑干等神经系统中，可作为检测小脑损伤的重要生化指标[16]。本文通过向新生大鼠腹腔内注射胆红素的方法建立新生儿高胆红素血症大鼠模型，结果显示，注射胆红素后，大鼠横木行走测试得分明显降低，小脑神经元凋亡率、血清S100β 及NSE 水平、凋亡相关蛋白（caspase-3、Bax）表达水平明显升高，表明胆红素可引发小脑神经元凋亡，造成小脑损伤，导致小脑神经功能障碍，揭示模型建立成功。

3.2 茵陈素促进自噬，抑制新生儿高胆红素血症模型大鼠小脑颗粒神经元凋亡

自噬是细胞在炎症、氧化应激和内质网应激等病理过程中的一种生存机制，增强自噬可减轻炎症、过氧化等各种应激损伤，促进细胞存活，抑制继发性脑损伤中的神经元凋亡，保护神经功能[3-4,17]。茵陈素是传统中药茵陈的主要有效成分，可抑制炎症、抗辐射、减轻化疗毒性，提高大鼠对缺氧的耐受度[9-10,12]，因而推测茵陈素可能通过抑制炎症而激活自噬、减轻胆红素诱导的小脑颗粒神经元凋亡。本研究结果显示，高胆红素血症模型大鼠经茵陈素处理后，其横木行走测试得分、自噬相关蛋白（Beclin-1、LC3B）表达水平升高，小脑神经元凋亡率、血清S100β 及NSE 水平、凋亡相关蛋白（caspase-3、Bax）表达水平降低，表明茵陈素可抑制胆红素诱导的炎症反应，激活自噬作用，减少小脑颗粒神经元凋亡，缓解小脑损伤，修复其神经功能。

3.3 茵陈素通过激活HIF-1α/BNIP3 通路而促进自噬，抑制胆红素诱导的小脑神经元凋亡

HIF-1α/BNIP3 信号具有调控细胞凋亡和自噬的双重功能，上调HIF-1α 及BNIP3 表达可促进细胞凋亡，同时通过增强细胞自噬作用而促进细胞存活。研究发现，三七总皂苷可激活HIF-1α/BNIP3 信号，减轻炎症，进而增强自噬能力，并保护心肌组织免于缺血再灌注损伤；另外上调HIF-1α/BNIP3 通路蛋白表达，可通过激活自噬而促使脊髓损伤后神经功能恢复[18-20]，因而HIF-1α/BNIP3 可作为促进自噬，减轻胆红素诱导的小脑颗粒神经元凋亡的潜在治疗靶点。本研究结果显示，模型大鼠凋亡相关蛋白（caspase-3、Bax）表达水平、自噬相关蛋白（Beclin-1、LC3B）表达水平、HIF-1α/BNIP3 通路相关蛋白（HIF-1α、BNIP3）表达水平升高，表明在胆红素诱导的小脑颗粒神经元凋亡过程中，自噬增强，但此时因细胞自噬而促进细胞存活的作用并不强，凋亡占主导地位，表现为小脑神经元凋亡增加；当以HIF-1α 抑制剂BAY87-2243 抑制HIF-1α/BNIP3 信号激活时，模型大鼠自噬相关蛋白（Beclin-1、LC3B）表达水平降低，小脑神经元凋亡率、血清S100β 及NSE 水平、凋亡相关蛋白（caspase-3、Bax）表达水平升高，表明下调HIF-1α/BNIP3 通路蛋白表达，可减弱自噬作用，促进小脑神经元凋亡，加重小脑神经功能损伤；以茵陈素+BAY87-2243 联合处理模型大鼠，与茵陈素单独处理相比，大鼠横木行走测试得分、自噬相关蛋白（Beclin-1、LC3B）表达水平、HIF-1α/BNIP3 通路相关蛋白（HIF-1α、BNIP3）表达水平降低，小脑神经元凋亡率、血清S100β 及NSE 水平、凋亡相关蛋白（caspase-3、Bax）表达水平升高，表明BAY87-2243 可减弱茵陈素增强自噬的作用，抑制小脑神经元凋亡，改善小脑神经功能的作用，揭示茵陈素可能通过激活HIF-1α/BNIP3 通路而促进自噬，抑制胆红素诱导的小脑神经元凋亡。

综上所述，茵陈素能激活HIF-1α/BNIP3 通路，增强自噬作用，抑制小脑神经元凋亡，减轻小脑损伤，促进其神经功能恢复，为新生儿高胆红素血症提供了新的临床治疗思路，HIF-1α/BNIP3 信号可能是其作用靶点，但HIF-1α/BNIP3 作为可促进细胞凋亡和自噬的双重功能的信号，其具体明确的调控机制，本文只是做了初步探索，还存在一定不足，后续还要进行深入研究。