γ-PGA发酵生产及提取工艺优化

冯世红,张宗华,王 飞,张晓勇,杨晓芳,高 帆,李 颖

(1.新疆氨基酸关键技术研究与应用创新团队,新疆 乌鲁木齐 831302;2.新疆微生物多糖工程技术研究中心,新疆 乌鲁木齐 831302;3.新疆阜丰生物科技有限公司,新疆 乌鲁木齐 831302)

γ-聚谷氨酸(γ-Polyglutamic acid,简称γ-PGA)是由多种杆菌产生的一种胞外多肽[1],最早是在1933年被发现存在于炭疽芽胞杆菌(Bacillusanthracis)[2]外荚膜中,1942年Bovarnick等[3]发现γ-聚谷氨酸也可由枯草芽孢杆菌产生。此后,尤其是进入21世纪之后,微生物发酵法生产γ-PGA受到越来越多研究者的关注[4]。γ-PGA是一种高分子氨基酸聚合物,由谷氨酸单体通过γ-酰胺键连接而形成。γ-PGA遇水可溶,可降解,无毒可食用,对环境无污染,是一种性能优良的大分子物质,在化工、医药、食品、农业、环境和日用品等领域均具有广阔的开发及应用前景[5]。目前,制备γ-PGA的主要方法是微生物发酵法[6]。主链上由大量肽键相连的γ-PGA,可被水解酶降解成短肽小分子和氨基酸单体,具有优良的生物相容性和生物可降解性[7],可用作生物和医用原材料。γ-PGA主链上存在大量游离羧基,亦可应用于制造化妆品、食品、分散剂、螯合剂、建筑涂料和防尘材料等[8-9],是药物前体制剂的一种理想载体。γ-聚谷氨酸还有止血、止体液渗漏作用,对持续性血液渗出、大动脉手术时血管出血均有较强的阻止效果,因此可用于制作止血纱布和止血胶带、人造皮肤以及手术缝合免拆线[10]。γ-PGA具有优良的保水性、缓释增效性和自身肥料效应等特性,适用作农业缓释肥料和可降解型聚合物包裹剂[11]。

笔者以枯草芽孢杆菌为发酵菌株,利用味精进行发酵产γ-聚谷氨酸。由于积累低聚糖和蛋白,发酵液黏度增大[12-13],以黏度高低确定最优γ-聚谷氨酸发酵条件,以最终得到的粗品产品品质来确定最佳提取工艺,为工业化生产γ-聚谷氨酸提供一定的理论基础及技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 材 料

谷氨酸钠,阜丰营销有限公司;酵母粉,安琪酵母股份有限公司;食盐,国药集团化学试剂有限公司;牛肉膏,北京鸿润宝顺科技有限公司;泡敌,陶氏化学有限公司;葡萄糖,齐齐哈尔龙江阜丰生物有限公司;硫酸镁,乌鲁木齐鑫汇鑫化工有限责任公司;磷酸氢二钾,宝鸡丰汇化工科技有限公司;氯化钙,新疆中冉化工有限公司;硅藻土,临江远通硅藻土新材料有限公司;活性炭,南平元力活性炭有限公司;盐酸,新特能源股份有限公司;乙醇,国药集团化学试剂有限公司。

1.1.2 主要仪器与设备

100 L发酵罐,上海百仑生物工程设备有限公司;台式高速离心机,上海仪电科学仪器有限公司;722S可见光分光光度计,上海菁华科技仪器有限公司;立式灭菌器,上海申安医疗器械厂;电子秤,上海寺冈电子有限公司;显微镜,OLYMPUS;旋转蒸发器,上海亚荣生化仪器厂;MTE-3000B全温振荡器,金坛市盛蓝仪器制造有限公司;NDJ-1型旋转式黏度计,上海越平科学仪器有限公司;高效液相色谱仪,安捷伦;双锥回转真空干燥机,常州市范强干燥设备有限公司;小板框,海宁市联众过滤设备;超净工作台,上海博迅实业有限公司医疗设备厂。

1.2 培 养 基

一级种子培养基:蛋白胨(BBI)1%,牛肉浸膏0.5%,氯化钠0.5%;pH不调(自然状态下大约6.5),在121 ℃下灭菌20 min,冷却备用。

二级种子培养基:酵母膏1.5%,氯化钠0.5%,牛肉膏1.0%,泡敌0.03%;pH为6.7±0.1,在121～123 ℃下灭菌30 min,冷却备用。

发酵培养基:1) 配方A为酵母膏7%,谷氨酸钠5.2%,氯化钠1.5%,氯化钙0.15%,泡敌0.1%;2) 配方B为硫酸镁0.15%,葡萄糖4.5%;发酵罐在120 ℃下灭菌30 min。配方A与B分别灭菌,配方A在120 ℃下灭菌10～15 min,118 ℃以上开始计时;配方B定容3 L,在115 ℃温度下灭菌10～15 min,混合后用NaOH调pH至6.5。

1.3 方 法

1.3.1 一级摇瓶种子培养

种子培养:在装有一定量种子培养基的三角瓶中进行一级培养,经灭菌后冷却,接入斜面菌种,37 ℃下摇床培养,转速为200 r/min,振荡幅度20 mm,培养12～14 h,OD值趋向于0.4最佳,置于4 ℃冰箱保藏备用。

1.3.2 二级种子罐发酵培养

在10 L发酵罐中装入二级种子培养基,装液量为55%(含冷凝水),先灭菌再冷却,接种15%的菌液进行发酵培养。培养条件为温度(37±0.5) ℃,罐压为0.05 MPa,风量为0.3 m3/h,通风比为0.8～1.0,转速为起始转速300 r/min,分3次提转速。第1次提速在发酵2 h时,转速提至360 r/min;第2次提速在发酵4 h时,提至420 r/min;第3次提速在发酵5 h时,转速稳定在480 r/min。培养6～8 h,菌体生长到用722S可见光分光光度计测吸光度A600增至3接种至发酵罐(OD测定数误差控制在0.3～0.8)。

1.3.3 发酵罐发酵培养

100 L发酵罐装液量40%(含冷凝水),接种量10%,温度为(37±0.5) ℃,pH为6.5～6.7,流加NaOH调节pH值,罐压为0.05 MPa,起始通风比为0.8,发酵液黏度增至约3 Pa·s时调通风比至0.95。起始转速为200 r/min,发酵的前10 h内提速4次,第1次提速设置发酵时间为0～2 h,提幅30 r/min;第2次提速设置在2～4 h,提幅50 r/min;第3次提速设置在4～8 h,提幅80 r/min;第4次提速设置在8～10 h,提幅50 r/min。10 h以后,根据发酵液黏度(4 Pa·s)的增长,最后提1次转速,提幅20 r/min。γ-聚谷氨酸发酵周期控制在40～50 h,随着菌体的生长,葡萄糖和谷氨酸会不断消耗,用生物传感仪测残糖为1%时开始流加质量分数为70%的葡萄糖,至黏度不再增长时结束发酵。

1.4 发酵液中γ-PGA的提取工艺流程

发酵结束后,发酵液中的γ-PGA通过稀释、酸化、加活性炭、硅藻土和乙醇等工艺流程逐步脱去色素及杂质,以达到提纯的目的。发酵液中γ-PGA的提取工艺流程如图1所示。

图1 γ-PGA的提取工艺流程图Fig.1 The process flow chart of γ-PGA extraction

提取工艺流程:

1) 发酵液为20 m3,放罐pH为7.0～7.5,加水10 m3,使料液达到A罐第二档搅拌叶位置处,加盐酸调pH为3.0～3.2,使用盐酸量为200～400 kg,料液黏度为10～15 mPa·s。A罐料液打入D罐。

2) 在D罐中加入辅料硅藻土450 kg(m(粗硅藻)∶m(细硅藻)=3∶1),活性炭450 kg;然后搅拌4 h,静置1 h,过1次板框。

3) 清液进入G罐,加硅藻土,活性炭,粗盐(按清液实际体积的1%加入),调pH至7.0,搅拌吸附4 h,过2次板框。

4) 清液进入E罐,加硅藻土,m(红硅藻)∶m(白硅藻)=1∶3,过3次超滤。

5) 清液从E罐进入蒸发器,浓缩一半水,浓缩液进E罐,调pH至5.0～5.5,料液调入F罐。

7) 将F罐料加至H罐,测酒精度,约90°时,停止入料,沉降去废酒。

8) 料液转入精制,离心,温度50 ℃烘干12 h,水分≤15%,粉碎,过筛,包装,成品。

1.5 试验分析检测方法

1.5.1 发酵液菌浓度的测定

OD测定法:稀释发酵液至规定浓度,取1 mL,在波长600 nm下检测其吸光值。

1.5.2 还原糖的测定

采用SBA-40生物传感分析仪测定。

1.5.3 黏度的测定

（7）加强邮轮专业管理和技术人才引进和培养。目前，我国从事邮轮码头服务、邮轮旅游服务和邮轮市场营销等方面的人才严重不足，有关部门应该尽快制定相关政策，大力挖掘、培养和引进相关人才。在邮轮相关服务教育培训方面，更应立足自身，放眼世界，寻求和国际著名邮轮公司或教育机构合作，共同建设致力于培育邮轮服务人员、邮轮管理人员以及旅游管理人员的邮轮人才培训中心，尽快提高从业人员的素质与水平。

使用NDJ-1型旋转式黏度计测定。

1.5.4 γ-PGA产量的测定

发酵液水解液处理方法:取稀释5倍的发酵液0.8 mL,加入水解管中,后加入1.2 mL浓盐酸,旋紧四氟材料的旋塞。置于灭菌锅中,121 ℃处理5 h。将水解液加入5 mL蒸馏水,后调节pH至6.5,并定容至25 mL。

未水解发酵液处理方法:将发酵液稀释50倍放置备用。

采用高效液相色谱仪测定上述已水解和未水解液中的谷氨酸质量分数。计算聚谷氨酸质量分数,即水解后的谷氨酸与水解前的谷氨酸质量分数的差值。

1.6 实验方法

为优化实验方案,结合枯草芽孢杆菌的生理特性,在前期大量试验的基础上,制定实验方案。

1.6.1 培养温度对γ-PGA合成的影响

为优化发酵罐培养温度,将培养温度分别设置为28,32,37,41 ℃,其他条件不变,检测发酵终止时发酵液的黏度。

1.6.2 谷氨酸钠质量分数对γ-PGA合成的影响

在相同发酵培养条件下,发酵培养基中谷氨酸质量分数分别设定为2.2%,3.2%,4.2%,5.2%,其他条件不变,检测发酵终止时发酵液的黏度。

1.6.3 乙醇对提取γ-PGA的影响

实验方案1(料入乙醇):

1) 取发酵液20 L缓慢加入80 L 95%的酒精中,加入的同时快速搅拌,料液中的γ-聚谷氨酸将大量凝聚在搅拌的铁棒上。

2) 将1)中得到的γ-聚谷氨酸取下,处理成小块,浸泡在95%的酒精中。

3) 将2)中得到的块状γ-聚谷氨酸置入双锥回转真空干燥机中55 ℃烘干12 h。

4) 将烘干后的γ-聚谷氨酸粉碎,过筛,得到γ-聚谷氨酸粗品。

实验方案2(乙醇入料):

1) 取发酵液20 L,然后将事先兑好的60%～70%的酒精溶液50 L缓慢加入发酵液中,同时快速搅拌,直至发酵液中出现麦粒大小的颗粒状,沉淀静置5～10 min。

2) 倒出上层清液,将底部的沉淀用95%的酒精提纯1次,同时快速搅拌,静置5～10 min,倒掉上清液,将γ-聚谷氨酸置入95%的酒精中静置。

3) 将2)中得到的γ-聚谷氨酸置入双锥回转真空干燥机中55 ℃烘干12 h。

4) 将烘干后的γ-聚谷氨酸粉碎,过筛,得到γ-聚谷氨酸粗品。

1.7 数据处理

实验重复3次,采用Excel 2013进行数据整理,采用OriginPro 2021软件绘图,数据结果用平均值±标准差来表示,显著性水平设置为0.05。

2 结果与讨论

2.1 不同发酵温度对γ-PGA生产的影响

发酵培养温度分别设置为28,32,37,41 ℃,按照γ-PGA发酵配方要求、发酵工艺参数控制要求进行发酵培养,发酵过程中需实时监测发酵液DO值。发酵过程中,当DO为0时,发酵液黏度开始增加,取样测定发酵液黏度,待发酵液黏度趋于稳定时发酵结束,不同发酵温度发酵结束时发酵液黏度如图2所示。

图2 不同发酵温度对γ-PGA生产的影响Fig.2 Effects of different fermentation temperatures on γ-PGA production

由图2可以看出:在温度为32 ℃时,发酵液产量和黏度最大。刘洁[6]在研究微生物发酵生产γ-PGA时,通过比对γ-PGA产量与其黏度关系曲线,发现发酵液中γ-PGA的产量达到最大值时,发酵液黏度以及γ-PGA的黏度也都达到了最大值。随着温度的升高,此后几天发酵液中γ-PGA的产量基本保持不变,而发酵液黏度和γ-PGA的黏度却呈下降趋势,这说明黏度的大小不仅与发酵液中γ-PGA的产量有关,而且与γ-PGA分子质量大小相关。现有研究发现:能够合成γ-PGA的微生物体中同时存在着降解酶或其基因,此酶可将γ-PGA大分子在γ-酰胺键位置断开,酶解成为小分子片段继续为微生物的生长提供能源[14]。韩文静等[15]在研究利用味精及副产品发酵生产γ-聚谷氨酸时,发现当发酵温度在32 ℃时,γ-PGA产量达到了最大值。综上所述,发酵温度确定为32 ℃。

2.2 谷氨酸钠添加量对γ-PGA合成的影响

以谷氨酸钠初始添加量分别为2.2%,3.2%,4.2%,5.2%进行批次发酵实验,发酵条件按照γ-PGA发酵配方要求、发酵工艺参数控制要求进行发酵培养,发酵过程中实时监测发酵液DO值。发酵过程中,当DO为0时,发酵液黏度开始增加,取样测定发酵液黏度,待发酵液黏度趋于稳定时发酵结束,不同谷氨酸钠添加量发酵结束时发酵液黏度如图3所示。由图3可以看出:当谷氨酸钠添加量质量分数为4.2%时,发酵液产量和黏度虽然都达到了最大值,但随着谷氨酸钠质量分数有所升高时,发酵液产量和黏度均有所降低。刘洁[6]在研究L-谷氨酸浓度对γ-PGA产量的影响时,发现γ-PGA产量的增加量与L-谷氨酸钠的添加量不呈正比,这表明投放的L-谷氨酸钠只有一部分用来合成γ-PGA,而另一部分以诱导物的形式存在来诱导枯草芽孢杆菌生产γ-PGA。依据生产经济性原则,确定谷氨酸钠的最优添加量为4.2%。

图3 谷氨酸钠添加量对发酵液黏度的影响Fig.3 Effect of sodium glutamate on viscosity of fermentation broth

2.3 乙醇对提取γ-PGA的影响

将实验1,2得到的γ-聚谷氨酸分别用40,60目的过筛装置,过筛后得到的粗品如图4所示。在实际生产过程中,有机沉淀溶剂对目标产物的沉淀和提取功能受温度、PH、沉淀时间、溶剂沉淀倍数和发酵液基质成分种类等多种因素的影响。通过多次分步提高乙醇的酒精度数,这种添加方式使结晶响应面的动力一直处于较高的水平,加速了单物质的沉积,减少了杂质的残积,最终获得品质较高的粗品。

图4 实验1,2的粗品图片Fig.4 Rough images of experiments 1 and 2

由图4可清楚地看出:2种粗品在颜色上有区别,实验2得出的γ-聚谷氨酸粗品比较白且粒径较小,说明方案2可有效去除发酵液中的色素、大分子蛋白和其他有机杂质。通过HPLC检测实验1和实验2所得2种粗品的γ-PGA质量分数,其值分别为68%和72%。因此选择乙醇入料的提取方式。

3 结 论

以枯草芽孢杆菌为出发菌株,以谷氨酸钠为原料进行发酵生产γ-聚谷氨酸。对γ-聚谷氨酸的发酵工艺和醇沉工艺进行研究,优化发酵工艺和提取工艺,实验结果表明:发酵温度为32 ℃时的发酵液黏度较高,γ-PGA产量与黏度呈正相关关系,且已有研究实验证明,当发酵温度为32 ℃时,γ-PGA产量达到最大值,故确定发酵温度为32 ℃;当发酵液中谷氨酸钠质量分数为4.2%时,发酵液黏度较高;采用乙醇入料这种提取纯化方式可有效去除发酵液中的色素、大分子蛋白和其他有机杂质。相较于将料加入乙醇中的提纯方式,这种乙醇入料的操作工艺提取的粗品纯度更高,质量更好,在实际工业生产中,该提取工艺也具有较高的参考利用价值。