谷氨酸钠肥胖大鼠下丘脑腹内、外侧核胃动素的表达研究

陈鲁曼+段旭艳+关真民

[摘要] 目的 研究谷氨酸钠诱导的肥胖大鼠下丘脑腹内侧核区和腹外侧核区胃动素阳性细胞的表达情况。方法 2014年11月—2015年6月期间从山东鲁抗制药有限责任公司购买60只刚出生的雄性Wistar大鼠随机平分为实验组和对照组（各30只），在第2、4、6、8、10天分别皮下注射等量谷氨酸钠和生理盐水。大鼠饲养至90 d时，取下丘脑行免疫组化染色，观察胃动素在下丘脑腹内侧核区、腹外侧核区的表达情况。结果 实验组有29只大鼠呈肥胖状态，显示谷氨酸钠诱导大鼠有98%因能量失衡呈肥胖状态；同时免疫组化评分显示：实验组和对照组的腹内侧核区、腹外侧核区阳性细胞率和中位数分别为（2.68±1.61）和2.12、（4.79±2.92）和4.67、（1.52±1.31）和1.44、（2.14±1.13）和1.62，实验组腹内侧核和腹外侧核胃动素阳性细胞与对照组相比均明显增加，差异有统计学意义（P<0.05）；实验组腹外侧核比腹内侧核胃动素阳性细胞增加明显，差异有统计学意义（P<0.05）；对照组大鼠下丘脑腹内侧核和腹外侧核胃动素阳性细胞之间差异无统计学意义（P>0.05）。结论 谷氨酸钠诱导的肥胖大鼠可以引起下丘脑腹内侧核区、腹外侧核区胃动素的表达增强。

[关键词] 谷氨酸钠；胃动素；下丘脑；肥胖大鼠

[中图分类号] R966 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742（2017）05（a）-0034-04

[Abstract] Objective To study on expression of motilin in ventromedial and lateral nucleus of hypothalamus of rat obesity？induced by glutamic sodium.Methods In November 2014 to June 2015 from shandong anti-lu pharmaceutical co.， LTD buy 60 newborn male Wistar rats randomly divided into experimental group and control group （30），on day 2，4，6，8，10 respectively were injected with normal saline and sodium glutamate.The 90 day， hypothalamus were performed immunohistochemical staining， observe the expression of motilin in hypothalamus of intra-abdominal， lateral nucleus. Results 29 only the experimental group rats were obese，Monosodium glutamate induced by 98% because of the energy imbalance in obese rats； And Immunohistochemical score shows： the experimental group and control group in the ventromedial nucleus， ventral lateral nucleus positive cell rate and the median was （2.68±1.61） and 2.68， respectively， （4.79±2.92） and 2.92， （1.52±1.31） and 1.31， （1.14±1.13） and 1.13， the ventromedial nucleus and ventrolateral experimental gastric dynamic element positive cells were significantly increased compared with control group， the difference statistically significant （P<0.05）； Experimental ventrolateral nucleus than the ventromedial nucleus gastric positive cells significantly increased， the difference statistically significant （P < 0.05）； Control the ventromedial nucleus in the rat hypothalamus and ventral lateral nucleus gastric dynamic element difference between positive cells has no statistical significance （P>0.05）. Conclusion It suggested that The obese rats induced by sodium glutamate can cause gastric dynamic element expression of hypothalamus.

[Key words] Glutamate；motilin； Hypothalamus； Obese rats

胃动素 （motilin，MTL）是由肠嗜铬细胞分泌的一种含有22种氨基酸的直链多肽，主要功能是促进胃肠运动，同时刺激胃蛋白酶的分泌[1]。近年来发现，MTL不但存在于消化系统，还存在于中枢神经系统，属于脑-肠肽的范畴。目前，国内探讨了胃动素在中枢神经系统各脑区的表达[2-3]，发现其受体广泛分布于脑内多个核团，在记亿、情绪、食欲、进食等方面可能起着广泛的调节作用，谷氨酸钠肥胖大鼠模型是单纯性肥胖的经典动物模型，但目前对谷氨酸钠作用肥胖大鼠中枢神经系统的具体机制还不十分清楚。该文拟通过2014年11月—2015年6月期间从山东鲁抗制药有限责任公司购买60只刚出生的雄性Wistar大鼠为研究对象，研究谷氨酸钠肥胖大鼠的下丘脑腹内侧核和腹外侧核区中胃动素阳性细胞表达特点进行研究，从而揭示下丘脑型肥胖大鼠胃动素阳性细胞表达的分布特点，为谷氨酸钠诱导的肥胖大鼠模型的形成機制提供理论依据，现报道如下。

1 材料和方法

1.1 肥胖模型制作

新生Wistar大鼠60只，雄性，体重（48.14 ±6.70）g，合格证号：scxk（鲁）2014-0006。按照随机平均原则分为实验组和对照组，各30只。在第2、4、6、8、10天分别给实验组大鼠皮下注射谷氨酸钠，对照组皮下注射等量生理盐水，3 mg/g体重，共5次。饲养至满月后进行断奶，饲养期间两组均给予常规饲料和水，一直持续8周时间，每天测量所有Wistar大鼠的体重及体长，并做好实验记录。然后根据Lee指数进行筛选计算，挑选出符合实验标准的Wistar大鼠。实验组肥胖大鼠和对照组正常大鼠各26只。

1.2 动物取材

所有合格大鼠均于出生后90 d时，断头取材。用10%的水合氯醛（国药准字H37022673）3 mL/kg行腹腔注射麻醉后，打开暴露大鼠的胸腔， 经左心室穿刺至主动脉，先用500 mL生理盐水冲洗，再用500 mL多聚甲醛（40 g/L）经升主动脉缓慢灌注，大约2 h。选择两组中灌注相对较好的实验大鼠各22只，采用断头开颅取下丘脑组织，取出后先用生理盐水进行冲洗，之后再用多聚甲醛（国药准字Z20090250）40 g/L固定8 h后，在20%蔗糖溶液中进行脱水，包埋。

1.3 ABC法免疫组化染色

利用Koning等的大鼠脑定位图谱，从大鼠下丘脑的腹内侧核和腹外侧核隆起所在的平面进行切片。该实验采用恒冷箱切片，间隔取片，切片厚约20 μm，每例共取5张。染色中所用抗体浓度MTL（1∶500）。染色具体步骤：冰冻切片用PBS漂洗约2 min，共3次；3%H2O2室温约10 min，再用PBS漂洗约2 min，共3次； 加15mL/ L封闭血清，室温孵育约30 min ，弃去血清不清洗，再加入MTL-R抗体（1∶500），在4℃进行孵育约24 h；取出之后室温放置2 h后，再用PBS漂洗3次；免疫组化染色阴性对照组用PBS代替第2抗体，其余步骤不变。

1.4 实验结果观察

免疫组化染色MTL-R阳性细胞的判定标准：阳性细胞表现为细胞核和细胞质不着色，细胞膜着黄色或棕黄色的细胞。统计时每1张染色切片高倍镜选取5个视野，采用二级计分的方法，按染色深浅评分：无着色计0分，淡黄色计1分，棕黄色或棕褐色计2分；再按照阳性细胞比例进行评分：无阳性细胞者计0分，25%阳性细胞者计1分，26%～50%阳性细胞者计2分，51%以上者计3分。最后將二者得分相加，就是综合免疫组化的最终评分：0定为阴性（-），1～2分为阳性（+），3～5分为强阳性（++）。

1.5 统计方法

对实验结果行应用SPSS 11.5统计学软件统计分析，各组计量以均数±标准差（x±s）表示，先行单因素方差分析，方差齐性检验后行配对LSD检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 实验组谷氨酸钠肥胖大鼠和对照组下丘脑腹内侧核、腹外侧核胃动素的表达情况

免疫组化染色结果显示：神经元细胞阳性表现为细胞核和细胞质不着色，细胞膜着黄色或棕黄色的细胞；部分神经纤维也呈阳性反应。实验组和对照组下丘脑腹内侧核和腹外侧核区均有阳性细胞出现，并且同区实验组阳性细胞均比对照组的阳性细胞有明显增多；阴性对照片结果阴性。见图1。

2.2 实验组谷氨酸钠肥胖大鼠和对照组下丘脑腹内侧核、腹外侧核胃动素阳性细胞率的比较

实验组谷氨酸钠肥胖大鼠下丘脑腹内侧核和腹外侧核胃动素阳性细胞与对照组相比均明显增加，差异有统计学意义（P<0.05）；实验组谷氨酸钠肥胖大鼠下丘脑腹外侧核比腹内侧核胃动素阳性细胞增加明显，差异有统计学意义（P<0.05）；对照组大鼠下丘脑腹内侧核和腹外侧核胃动素阳性细胞之间差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。

3 讨论

随着经济水平的不断提高，人们的生活和医疗条件也在不断改善，老龄化程度也在进一步加重，更多的老年性疾病患者出现，其中最突出的老年性疾病是肥胖，研究发现肥胖症儿童发病率逐年增加是造成青少年无症状转氨酶增高的主要原因，部分可以转化为肝纤维化和肝硬化，甚至终末期肝病肝纤维化为病程发展的重要环节[4]，肥胖已经演变为现代社会生活的一种流行病。据统计我国的肥胖发病率已经从2002年的7.1%逐步上升到了11.9%[5]，肥胖已经成为一种严重的公共健康问题。肥胖症（adiposity）是一组由于摄食和能量调节紊乱引起的慢性代谢性疾病症候群[6]，因肥胖症引起的糖尿病、高血压病、恶性肿瘤、不孕不育等正呈现逐年递增的趋势。因此，肥胖已经成为影响人类健康的最主要的危险因素之一。但是对肥胖及其相关性疾病的产生机制以及防治措施的研究还处于初级阶段。尤其对于肥胖症患者的食欲中枢调节机理成为目前研究的热点问题，目前比较成熟的动物模型是谷氨酸钠肥胖大鼠模型，谷氨酸钠肥胖大鼠的产生机制可能是与下丘脑弓状核神经肽Y的表达活性增强有关，神经肽Y活性超表达可以积极促进大鼠机体脂肪组织的生成增加，从而引起下丘脑神经细胞分泌瘦素显著增加[3]。近几年研究证明很多肽类激素都已经被归属为肥胖相关肽，但MTL对摄食及体重的影响目前还没有公认的研究结论。

MTL作为一种脑-肠肽，在中枢神经系统的功能和作用的研究已经取得了一些成果：王洪忠等[7]研究发现胃动素可通过抑制大鼠下丘脑 PVN 神经元细胞电压依赖性钾电流，发挥其增强胃肠运动的作用。胃动素受体在中枢神经系统广泛分布，尤其是与摄食、记忆、学习等功能研究有关。张梅等[8]研究发现阿奇霉素促进胃排空的机制可能为小剂量下仅为胃动素样作用；中剂量、大剂量时除胃动素样作用外，有内源性胃动素参与。因而研究谷氨酸钠肥胖大鼠的中枢调节机制和胃动素表达意义重大。

该实验结果实验组有29只大鼠呈肥胖状态，显示谷氨酸钠诱导大鼠有98%因能量失衡呈肥胖状态，与之前刘铭瑶等[9]研究的谷氨酸钠造模大鼠的体重、Lees指数（（体重/g）1/3×103/体长/cm）、腹部脂肪质量显著高于同期正常对照组（P<0.01），提示大鼠造模成功的结果相一致。并且免疫组化的结果也证实实验组的肥胖大鼠在中枢神经系统的下丘脑腹内侧核和腹外侧核区胃动素阳性细胞数量明显增多，实验组和对照组的腹内侧核区、腹外侧核区阳性细胞率和中位数分别为（2.68±1.61）和2.12、（4.79±2.92）和4.67、（1.52±1.31）和1.44、（2.14±1.13）和1.62，实验组腹内侧核和腹外侧核胃动素阳性细胞与对照组相比均明显增加，差异有统计学意义（P<0.05）；实验组腹外侧核比腹内侧核胃动素阳性细胞增加明显，差异有统计学意义（P<0.05）；对照组大鼠下丘脑腹内侧核和腹外侧核胃动素阳性细胞之间差异无统计学意义（P>0.05）。这些实验结果都说明胃动素受体被激活以后，可能直接作用于摄食相关中枢，使大鼠增加摄食； 胃动素还有可能作为一种神经递质通过神经-体液调节机制，增加胃肠动力，缩短胃肠排空时间，增加其饥饿感，使摄食增多。这与刘梅等[10]对动物的侧脑室注射胃动素后使其进食量大量增加，可能与这些动物神经中枢的胃动素受体有关的结论相一致。

综上所述，这些结果提示谷氨酸钠诱导大鼠肥胖的原因可能跟下丘脑腹内侧核、腹外侧区胃动素阳性细胞表达增加有密切关系。谷氨酸钠可以诱导大鼠的这两个区域的胃动素受体数量增加，胃动素受体一旦被激活，大鼠食欲就会加大，体重随之增加。但对于下丘脑的其它核区是否还有胃动素阳性细胞表达的改变，还需要进一步研究，为肥胖症的治疗和药物开发提供理论依据。

[参考文献]

[1] 刘梅，董蕾，段钟平，等.胃动素受体在大鼠各脑区的分布[J].西安交通大学学报：医学版，2010（31）5：548-552.

[2] 赵淑玲，陈云霞，高倩.膳食脂肪对肥胖患者胃肠激素的影响[J].医学综述，2017，23（3）：598-604.

[3] 赵军，高宝柱，郑宝森，等.中枢神经系统胃动素的分布及其对胃肠动力调控的机制[J].国际麻醉学与复苏杂志，2013，34（4）：379-382.

[4] Brunt E M.Nonalcoholic fatty liver disease： pros and cons of histologic systems of evaluation[J].Int J Mol Sci，2016，17（1）：97.

[5] 赵丽云，刘素，于冬梅，等.我国居民膳食营养状况与《中国食物与营养发展纲要（2014—2020 年） 》相关目标的比较分析[J].中国食物与营养，2015，21（8）：5-7.

[6] 李方方，李东阳，赵红.肥胖对骨质疏松症分子水平影响的研究进展[J].山东医药，2014，54（29）：106-108.

[7] 王洪忠，李莉，韩波，等.胃动素对大鼠下丘腦PVN神经元细胞电压依赖性钾电流的影响[J].中国医学创新，2014，25（11）：13-15.

[8] 张梅 董湘玉.阿奇霉素对大鼠胃排空及胃动素浓度影响的研究[J].甘肃医药，2016，35（3）：165-168.

[9] 刘铭瑶，王菁，侯玉婷，等.FGF-21改善谷氨酸钠引起的体内脂肪堆积[J].哈尔滨工业大学学报，2016，48（2）：119-125.

[10] 刘梅，郑素军，董蕾，等.侧脑室注入胃动素对大鼠摄食及学习记忆能力的影响[J].西安交通大学学报：医学版，2011，32（1）：42-46.

（收稿日期：2017-02-04）