超高压处理对变温结晶制备糯米慢消化淀粉的影响

吴怡瑾，郑方园，林 丽，高雨晨，杜先锋

（安徽农业大学 安徽省农产品加工工程实验室，安徽 合肥 230036）

根据淀粉的酶解速率，将在小肠中可以被完全消化吸收且在20～120 min内被酶解的淀粉定义为慢消化淀粉（slowly digestible starch，SDS）[1]。而较高含量SDS可减慢食品被消化过程中葡萄糖释放速度，有益于人体健康[2-3]，目前制备SDS的主要方法包括物理、化学、生物及复合方法。变温结晶是指由于淀粉无定形和结晶区域中淀粉运动的水平不同[4-5]，将淀粉样品先放置在低温（玻璃化转变温度Tg）下使成核速率达到最高，再放置在高温（熔融温度Tm）下使晶体扩散速率达到最高，这样因温度循环而引起淀粉成核-扩散的过程，其可促使更多不完美晶体的形成，从而得到SDS含量更高的样品[6-7]。

超高压作为一种新型的淀粉物理变性手段，当水分存在时可使淀粉颗粒的晶体结构发生不可逆破坏，非结晶区也会与水分发生水合作用，进而破坏淀粉的整个颗粒结构[8]。在制备之前使用超高压处理样品进一步破坏淀粉分子结构，可对后期变温结晶获得高SDS含量的样品有一定影响。

糯米（Oryza sativaL. var.Glutinosa Matsum.）中的淀粉主要由支链淀粉[9]和中间级淀粉组成，其直链淀粉相对含量较少而支链淀粉相对含量超过70%[10-11]。支链淀粉含量高更有利于不完美晶体的形成。而蛋白质作为物理屏障存在于淀粉颗粒的表面[12]，可能会阻碍淀粉被消化，二者以氢键、静电力、范德华力等分子间相互作用相结合[13]。但目前的研究中缺乏有关糯米中蛋白质对淀粉消化率的影响。

目前的研究主要集中于抗性淀粉以及不同种类淀粉变温结晶所得SDS的性质。本研究采用变温结晶的方法制备糯米SDS，在制备之前使用超高压处理样品进一步破坏淀粉分子结构，探究在后续变温结晶的过程中此处理对SDS含量的影响结果，为获得具有健康功效的SDS提供新的绿色环保制备思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

太湖糯 益海嘉里金龙鱼粮油食品股份有限公司；α-淀粉酶、糖化酶 上海源叶生物科技有限公司；乙醇、磷酸氢二钠、冰醋酸、氢氧化钠 国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

Kjeltec 8400全自动凯氏定氮仪 瑞典福斯公司；超高压装置 包头科发高压科技有限责任公司；DSC8000差示扫描量热（differential scanning calorimetry，DSC）仪美国PE公司；RVASuper3快速黏度分析（rapid visco analysis，RVA）仪 美国Newport科技公司；Nicoletteis50傅里叶变换红外光谱（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR） 美国Thermo Fisher Scientific公司；JW-3021H高速离心机 安徽嘉文仪器设备有限公司；UV-5500紫外-可见分光光度计 上海元析仪器公司；Christ Gamma冷冻干燥机 北京博万力行仪器有限公司；真空包装机 合肥逸飞包装机械有限公司。

1.3 方法

1.3.1 糯米粉及糯米淀粉的制备

糯米洗净后浸泡6 h，使用匀浆机打匀后放入烘箱40 ℃烘干后粉碎，过100 目筛网，得糯米粉（以下简称为P组）。糯米洗净后浸泡6 h，使用匀浆机打匀后按体积比1∶1加入质量分数0.25%的NaOH溶液反复洗涤去除蛋白质和其余杂质，放入40 ℃烘箱烘干后粉碎过100 目筛网[14]，得糯米淀粉（以下简称为S组）。

1.3.2 基本化学成分的测定

水分质量分数采用红外水分快速测定仪测定；灰分质量分数采用GB 5009.4—2016《食品安全国家标准 食品中灰分的测定》测定；蛋白质量分数采用GB 5009.5—2016《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》测定；粗淀粉质量分数采用GB/T 5006—1985《谷物籽粒粗淀粉测定法》测定。

1.3.3 超高压处理样品

分别称取约100.0 g糯米粉和100.0 g糯米淀粉以料液比1∶2加入纯水，沸水浴15 min，真空袋密封后放入超高压装置，分别在0、100、300、500 MPa的超高压强度和20 ℃的温度条件下保持20 min。

1.3.4 变温结晶制备慢消化淀粉样品

将超高压处理好的样品编号后装入烧杯，随后在变温结晶条件（4 ℃和25 ℃循环，时间间隔24 h）下放置1、3、7 d（以下简称D1、D3和D7）后将样品冷冻干燥，磨粉之后过100 目筛网放入密封袋储存。以糯米粉（P）/糯米淀粉（S）-压强（0～500）-储藏时间（D1、D3、D7）为编号命名。

1.3.5 慢消化淀粉质量分数测定

参考文献[15]测定慢消化淀粉质量分数。准确称取0.29 gα-淀粉酶（1×105U/g）用纯水定容至100 mL，记为A酶液，0.10 g糖化酶（1×105U/g）用pH 5.2的0.20 mol/L磷酸缓冲液定容至100 mL，记为B酶液，取85 mL A酶液和15 mL B酶液充分混合得到混合酶液并37 ℃保温5 min。准确称取0.20 g变温结晶制备的SDS样品放入50 mL离心管中，加入15 mL、pH 5.2的0.20 mol/L的磷酸缓冲液和10 mL混合酶液，在37 ℃恒温水浴下分别振荡20 min和120 min后，取0.5 mL样液，加入4 mL无水乙醇进行灭酶处理，用3,5-二硝基水杨酸比色法[16]测定还原糖含量，每个样品平行测定3 次，取平均值。按下式计算SDS质量分数。

式中：G20指的是20 min后酶解释放的还原糖质量/g；G120是120 min后酶解释放的还原糖质量/g；TS是每次测试所用SDS样品的淀粉总质量/g。

1.3.6 热力学性质测定

准确称取0.01 g的样品粉末置于铝制坩埚中，使用压盖机密封坩埚。样品测定步骤：升温程序为30～120 ℃，升温速率为7.3 ℃/min。使用TA分析软件分析计算样品的糊化温度以及糊化焓[17]。

1.3.7 糊化特性分析

称取2.5 g样品和25 mL蒸馏水加入RVA仪样品铝罐中。设定程序为以960 r/min的速率在50 ℃下保持10 s，然后将转速降至160 r/min，并在50 ℃下保持1 min，然后加热到95 ℃并保持2.5 min，然后在3.8 min内冷却到50 ℃并保持2 min[18]。

1.3.8 傅里叶变换红外光谱测定

称取1.0 mg样品与100.0 mg溴化钾在石英研钵中研磨均匀，压片。将溴化钾压片置于FTIR仪内进行扫描，扫描范围为4 000～400 cm－1，样品扫描次数16 次，分辨率4 cm－1。

1.4 数据处理与分析

采用Origin 8.5软件处理数据和作图。结果用平均值±标准差的形式表示；采用SPSS 20.0软件对所得数据进行方差分析，以P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 糯米粉和糯米淀粉的基本成分组成

由表1可知，P组的蛋白质量分数为7.97%，S组为0.58%，S组蛋白质量分数显著低于P组（P＜0.05），而S组的淀粉质量分数达到89.98%，显著高于P组（P＜0.05）。两组的水分质量分数、灰分质量分数及脂肪质量分数并没有显著性差异。

表1 糯米粉和糯米淀粉样品的基本成分含量Table 1 Proximate composition of glutinous rice powder and glutinous rice starch

2.2 超高压处理对糯米粉及糯米淀粉形成SDS的影响

由图1可知，P组的SDS质量分数在1、3、7 d各组间差距很小，但随着储藏时间的延长缓慢上升，第1天时的SDS质量分数为9.11%～12.37%，第3天时为14.59%～18.29%，第7天时为14.60%～18.29%。S组的SDS质量分数同样随时间的延长呈增加趋势，且增加幅度更明显。总体来看，同一储藏时间和压强处理下，对比P组，S组的SDS质量分数更高，且储藏时间越长，即反复结晶的时间越长，同一压强处理下，与P组相比，S组中的SDS质量分数增加幅度更大。500 MPa处理后的样品变化最为明显，上升趋势及幅度最大，在第7天时SDS质量分数可达到30.32%。SDS质量分数与所处理压强呈现正相关。

图1 不同强度超高压处理的糯米粉在不同储藏时间的SDS质量分数Fig.1 Change in purity of SDS from glutinous rice flour treated with different UHP intensities at different storage times

糯米粉相比于糯米淀粉中有大量的淀粉-蛋白质复合物，蛋白质和淀粉之间的相互作用本质上主要是淀粉的阴离子基团和蛋白质的正电荷基团之间的静电作用力[19]。超高压处理并不能完全破坏这种静电作用力，故不同强度超高压处理后的P组在同一时间下SDS质量分数差异不明显。这表明围绕在淀粉表面充当物理屏障的表面蛋白等结构能够有效地阻碍淀粉的快速消化[20]。而去除掉大部分蛋白质及脂质的糯米淀粉，其淀粉颗粒更大几率暴露在表面，在反复变温的作用下，支链淀粉相互缠绕并开始重结晶。由于直链淀粉主要影响淀粉短期回生（数小时），支链淀粉主要影响淀粉长期回生（数天）[21]，且糯米淀粉中淀粉，尤其是支链淀粉含量高，故相比于P组，S组回生形成不完美结晶的可能性更高。

由于样品被置于晶体成核速率和晶体扩散速率都为最高的温度条件下，回生时间越长淀粉链碰撞活动重结晶的几率越大，故样品总体SDS质量分数随着时间延长而增加。可发现500 MPa的处理条件下，S组在第3天时SDS质量分数就已经比其他处理组明显更高，在第7天时达到最高（30.32%）；100 MPa和300 MPa处理的S组虽然在第3天的SDS质量分数与第1天比变化量并不大，但在第7天时明显增加。说明超高压处理可以打开淀粉颗粒间紧密结合的非共价键，从而使提取的糯米淀粉中少量未被除净的蛋白质、脂质与淀粉颗粒脱离。超高压的压强越大，打开的非共价键数量越多，故暴露在外的淀粉颗粒表面积越大，在回升过程中更可能重结晶形成SDS。

2.3 SDS样品热力学性质分析结果

由表2可知，P组经变温结晶所制得样品的熔融温度（Tc）为103.16～109.08 ℃，峰值温度（Tp）为102.50～108.54 ℃，焓变（ΔH）为0.16～0.56 J/g；而S组经变温结晶所制得样品To为99.22～107.32 ℃，Tp为99.48～107.50 ℃，ΔH为0.010～0.410 J/g。P组和S组不同样品之间的Tc以及Tp并没有明显的变化趋势。对比P组和S组的ΔH，可发现P组总体显著大于S组（P＜0.05）。P组的ΔH随着储藏时间的延长而增加，在1～3 d为0.160～0.331 J/g，在第7天时显著提高并达到最高（0.468～0.561 J/g）。同样，S组的ΔH随着储藏时间的延长而增加，第1天时为0.032～0.090 J/g，而第7天时为0.279～0.410 J/g。

表2 不同条件处理下样品的糊化特性Table 2 Gelatinization characteristics of SDS under different conditions

对于变温结晶制备的SDS样品，热稳定性是一个重要的评价指标。P组和S组的ΔH之所以随着储藏时间的延长而增加，可能是由于随着储藏时间的延长，样品中重结晶部分所占比例提升，故淀粉有序结构比例提升。由于SDS的形成可以表征为晶体结构中短线性链双螺旋的聚集和排列[22]，而新形成的双螺旋结构会比原来的结构更加紧密，结构间的作用力更强，故焓的增加归因于结晶和超高压过程中双螺旋结构的重新组装。比起淀粉糊化之后的无序形态，这些短程有序结构需要更多的热量才能被破坏，故无论是P组还是S组，经过DSC仪所测的ΔH在第7天时都有所上升。淀粉与蛋白质的相互作用会改变混合物的热特性和影响淀粉的回生，研究表明蛋白质可以延缓淀粉的老化回生[23]，故P组ΔH总体显著大于S组（P＜0.05）。

2.4 SDS样品糊化特性分析结果

对比分析图2～5，相比于未处理P组和S组的RVA曲线，经变温结晶处理之后的样品黏度随温度升高一开始便达到最高，随后随着温度的上升呈现下降趋势，而当温度下降时，黏度又再次呈现上升趋势，测定结果中只有最低黏度、最终黏度、崩解值和回生值，没有峰值黏度。P组的最终黏度随着压强的增加而增大，但其回生值变化并不明显。而S组的最终黏度随着压强的增大而减小，回生值随着压强增大而下降。将P组和S组对比来看，储存到第7天时，S组的回生曲线明显高于P组，S组的最终黏度大于P组。

由于处理组样品已经完全糊化溶胀破碎，故黏度从一开始便达到最大值，而随着温度的升高，样品中淀粉分子无序化程度加强，黏度呈下降趋势。当温度下降，淀粉分子重新结晶成有序结构，形成凝胶状物质，黏度再次增加，故变温结晶的曲线呈凹型。图2～5中，P组的最终黏度总体随着压强的增加而增大，这可能是因为随着压强的增加，在一定程度上打开淀粉分子与蛋白质紧密结合的非共价键，形成黏度较高的凝胶状。而S组中的回升值随着压强增大而下降，说明其凝胶回升能力是随着压强的增大而减小的。这是因为压强越大，S组的SDS含量越高，其已形成的有序结晶程度越大，故同等条件下打开样品中有序结晶结构的要求越高，其回生能力减小。同时随着压强的增大，S组的最终黏度总体也在减小，这是因为经过超高压变温结晶处理的淀粉中原本的淀粉颗粒完整性丧失。淀粉重结晶形成有序的晶体结构，阻止了淀粉的溶胀。黏度和短程有序结构有相关性，短程有序结构比例越大，黏度越小[24]。糯米粉内有蛋白质、脂质，可与淀粉形成复合物，这些复合物相互作用导致蛋白质网络与淀粉颗粒结合从而限制水的进入。P组中淀粉分子和蛋白质结合阻碍了淀粉吸水溶胀，所以其最终黏度较低，且一些氨基酸通过氢键或疏水作用黏附在蛋白质颗粒表面上，导致其回生值变小，这与文献[25]的研究结果一致。

图2 未经处理的糯米粉和糯米淀粉的RVA曲线Fig. 2 RVA curves of untreated glutinous rice flour and glutinous rice starch

图3 储藏到第1天时不同强度超高压处理的糯米样品的RVA曲线Fig. 3 RVA curves of glutinous rice samples treated with different UHP intensities after storage for 1 day

图4 储藏到第3天时不同强度超高压处理的糯米样品的RVA曲线Fig. 4 RVA curves of glutinous rice samples treated with different UHP intensities after storage for 3 days

图5 储藏到第7天时不同强度超高压处理的糯米样品的RVA曲线Fig. 5 RVA curve of glutinous rice samples treated with different UHP intensities after storage for 7 days

2.5 SDS样品傅里叶变换红外光谱分析

如图6～8所示，通过FTIR测定，P组和S组在900～4 000 cm－1之间出峰位置几乎相同，但是P组在1 560 cm－1处出现一个代表—NH2的特征峰[26]，这是因为对比S组，P组蛋白含量较高。糯米淀粉和糯米粉均在3 100～3 600、3 000～2 800 cm－1和1 640 cm－1有3 个特征峰出现，分别代表O—H、C—H和CH2[27]。

图6 储藏到第1天时不同强度超高压处理的糯米样品的FTIRFig. 6 FTIR spectra of glutinous rice samples treated with different UHP intensities after storage for 1 day

图7 储藏到第3天时不同强度超高压处理的糯米样品的FTIRFig. 7 FTIR spectra of glutinous rice samples treated with different UHP intensities after storage for 3 days

图8 储藏到第7天时不同强度超高压处理的糯米样品的FTIRFig. 8 FTIR spectra of glutinous rice samples treated with different UHP intensities after storage for 7 days

经变温结晶和高压处理后，糯米SDS样品的特征峰没有明显变化，说明与超高压结合进行变温结晶的过程并没有改变糯米SDS样品分子链的基团，样品中发生的改变仅涉及淀粉分子内氢键的重组。变温结晶的SDS样品在回生过程中，其构象、螺旋含量、螺旋聚集程度和其他短程有序结构在超高压处理之后可能发生改变。因此，将上述FTIR结果进行去卷积处理以研究由氢键形成引起的短程有序结构变化程度。研究表明，FTIR技术测定的是淀粉的短程有序结构，短程有序是指双螺旋有序而不是与双螺旋堆积有关的长程有序[28]。而1 047 cm－1和1 022 cm－1处的谱带强度分别反映了淀粉的结晶区域和非晶区域，1 047 cm－1/1 022 cm－1峰强度比值反映了淀粉中短程有序结构所占比值，比值越高表明淀粉中含有较多的短程有序结构[29-30]。由图9～11可以看出，随着变温结晶时间的延长，1 047 cm－1/1 022 cm－1的峰强度比值在逐渐增加，第1天的比值范围为0.86～1.34，第3天的比值范围为1.10～1.54，第7天的比值范围为1.48～1.70；且随着超高压压强的升高，P组的峰强度比值无明显变化，而S组的峰强度比值随之升高，在第7天时500 MPa处理的S组样品峰强度比值可以达到最高（1.70）；且S组的峰强度比值始终高于P组。同样是因为随着时间的延长、压强的增加，S组变温结晶形成的短程无序结构比例增大，印证了SDS作为短程无序结构的主要成分含量增加的趋势；而P组相同时间、不同压强下1 047 cm－1/1 022 cm－1的峰强度比值差异并不大，也印证了因为P组中蛋白的存在而导致结晶变化并不明显。此结果与之前SDS含量的变化、热力学性质以及黏度趋势相同。

图9 储藏至第1天时糯米样品在1 047 cm－1和1 022 cm－1处峰强度比值Fig. 9 Peak intensity ratio between 1 047 cm-1 and 1 022 cm-1 of glutinous rice samples stored for 1 day

图10 储藏至第3天时糯米样品在1 047 cm－1和1 022 cm－1处峰强度比值Fig. 10 Peak intensity ratio between 1 047 cm-1 and 1 022 cm-1 of glutinous rice samples stored for 3 days

图11 储藏至第7天时糯米样品在1 047 cm－1和1 022 cm－1处峰强度比值Fig. 11 Peak intensity ratio between 1 047 cm-1 and 1 022 cm-1 of glutinous rice samples stored for 7 days

3 结 论

超高压处理可以让样品淀粉中部分紧密结合的分子间作用力打开，故变温结晶过程中淀粉重结晶缠绕形成新结构的几率更大，因此压强越大，SDS含量越高。而随着时间延长，淀粉回生形成有序结晶的比例增加，故超高压处理之后的样品经过变温结晶温度循环回生之后，其SDS含量随着储藏时间的延长而增加；与糯米粉相比，糯米淀粉不含蛋白质，其支链淀粉更易在回生过程中重结晶形成SDS，故糯米淀粉样品的SDS含量相比于糯米粉样品增加的幅度更大。