原代滑膜细胞培养及同时提取微量总RNA和蛋白质的方法在体外细胞分子生物学研究中的应用

熊翱，熊仁平，彭艳，黄治中，陈惺，江旭，曹福洋，许建中

原代细胞培养技术是广泛应用于疾病体外研究的重要方法之一[1,2]，对原代培养的细胞进行分子生物学研究，可以排除其他细胞干扰，提高生物信息的准确性和特异性，进一步保证研究结论的可靠性。但原代细胞培养成功率低，有时纯度达标困难。解决了纯度问题，又会出现可用于实验研究材料的原代细胞的代数不多，仅2～3代可用[3,4]，传至4代以后的细胞就老化的问题，不能保持原代细胞原有的特征和功能。

采用传代的原代细胞培养进行体外分子生物学研究，必须保证传代细胞具有原有细胞的生物学行为；确保原代培养体系的细胞健康状况良好；确保传代细胞的任一组分功能与原有细胞都无差异。原代细胞的分子生物学研究中，核酸（RNA、DNA）和蛋白质一直是其研究的主要内容。以往国内研究人员从原代培养细胞中提取RNA和蛋白质，都是参考国内外文献[5-7]，分别从原代培养细胞中提取。这样提取RNA和蛋白质费时费力，更突出的缺点是浪费资源（需两份培养细胞）、花费更多的经费（试剂重复使用）、操作繁锁（易受外界RNA酶污染）、延长研究周期[8-10]。这就使原代培养细胞实验研究工作的进展慢，不利于研究工作的顺利开展。因此，如何对培养的可用于实验研究的原代细胞做到物尽其用，从而节约经费、降低劳动成本、缩短研究周期是亟待解决的问题。

本研究为了最大限度地发挥原代细胞的作用，在成功培养Sprague-Dawley（SD）大鼠原代滑膜细胞的基础上，探讨从原代培养的具有滑膜主要功能细胞之称的成纤维样滑膜细胞（fibroblast-like synoviocytes,FLS）[11,12]中同时提取微量总RNA 和蛋白质。同时运用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）和免疫印迹（Western blot）方法检测滑膜原代FLS 的特征因子白介素-1β（interleukin-1β,IL-1β）和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）的mRNA 和蛋白质表达情况，同时与传统的分别提取微量总RNA和蛋白质的IL-1β 和TNF-α 的基因和蛋白质表达情况进行比较，探讨同时从一份原代培养细胞中提取微量总RNA和蛋白质的可能性。

1 材料与方法

1.1 实验动物

两月龄SPF 级雄性SD 大鼠，200～240 g，购于陆军军医大学陆军特色医学中心实验动物中心［SCXK（军）2017-0026］，饲养于陆军军医大学陆军特色医学中心实验动物中心［SYXK（军）2017-0058］。动物实验操作严格按照陆军军医大学实验动物伦理学要求执行（审批号：AMUWEC20181430），同时严格按照实验动物使用的3R（Reduction，减少；Refinement，优化；Replacement，替代）原则给予人道关怀。

1.2 主要试剂与仪器

戊巴比妥钠（进口分装，德国），DMEM（high Glucose，BI，美国）,双抗（GiBco，美国），Ⅰ型胶原酶（abcam，美国），0.25%胰酶（GiBco，美国），小鼠抗vimentin 单抗（abcam，中国香港），兔抗IL-1β 多抗（abcam，中国香港），兔抗TNF-α多抗（cell signaling，美国），2×PCR mix（Bimake，美国），2×master mix（Promega，美国），TRIzolTMReagent（invitrogen，美国）。CO2培养箱（Thermo，美国），T100TM梯度PCR 仪（BioRad，美国），CFX ConnectTMqPCR 仪（BioRad，美 国），ELX800 酶标仪（BioTek，美国），Western blot 实验系统（BioRad，美国）。所有器皿和所配溶液均按细胞培养和提取总RNA要求准备。

1.3 滑膜组织的分离、滑膜细胞的原代培养及其纯度与增殖鉴定

参照熊翱等[13]建立的方法完成。

1.4 总RNA和蛋白质的提取

采用经鉴定的FLS 纯度在98%以上的第6 代原代细胞，调整细胞密度为4×104/ml。0.2 ml/孔接种至6 孔板，培养至细胞融合度达80%时，调整并计数细胞。转移原代培养细胞悬液至1.5 ml离心管，使其细胞数为5×105。总计准备12 份原代培养的第6 代FLS。每次的平行样品数均为4。

1.4.1 经典法［酸性硫氰酸胍苯酚氯仿（acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform,AGPC）］[14]提取总RNA试剂配制

柠檬酸钠-月桂酰肌氨酸-β-巯基乙醇（citratesodium-sodium N-lauroyl sarcosinate-betamercaptoethanol,CSB）缓冲液（42 mmol/L 柠檬酸钠，pH 4.0，8.3 g/L N-月桂酰肌氨酸和0.2 g/L β-巯基乙醇）；快速总RNA 提取试剂：用CSB 配制4 mol/L 异硫氰酸胍；加入0.15 体积4 mol/L乙酸钠（pH 4.0）；加入等体积酸酚，混匀。4℃保存备用。

1.4.2 SDS-裂解法提取总蛋白质的试剂配制

预先配制10%（W/V）SDS 和0.5 mol/L Tris-HCl pH 8.0，室温保存备用；预先配制1 mol/L二硫苏糖醇（dithiothreitol，DTT），-20℃保存备用。提取总蛋白时，按以下配方现配SDS-裂解液：0.5%（W/V）SDS，0.05 mol/L Tris-HCl pH 8.0，0.1 mol/L DTT。

1.4.3 总RNA提取、质量、纯度鉴定和浓度测定

取8份原代培养FLS细胞，低速离心，弃培养基，用含二乙基焦磷酰胺（diethyl pyrocarbonate,DEPC)的PBS洗涤2次，然后随机分成两组，每组4份。第一组加入AGPC RNA 提取试剂0.5 ml；第二组加入Invitragen 公司的TRIzolTM试剂0.3 ml。冰浴下超声破碎细胞5 s×2次，4℃，孵育5～10 min。之后，每管加入100 μl冰浴后的氯仿，震荡15 s。4℃静置10 min后，12 000×g，4℃离心15 min，收集透明水相到新的离心管中（其余两相供蛋白质提取用）。每管加等体积异丙醇（-20℃预冷），混匀，12 000×g，4℃离心10 min，弃上清，加75%乙醇洗涤并沉淀总RNA。真空或空气干燥总RNA。最后用DEPC处理的超纯水15 μl溶解沉淀。详细总RNA 提取操作：AGPC 提取RNA 按文献[14]方法改进执行；TRIzolTM法提取RNA 按Invitrogen的用户指南介绍的方法改进执行。

取4 μl RNA 样品加DEPC 处理过的双蒸水至13 μl，加RNA载样缓冲液7 μl，煮沸5 min后置冰中，然后上样，进行0.8%甲醛琼脂糖凝胶电泳（预电泳50 V，15 min；电泳60 V，40 min），检查RNA 的完整性。主要观察28 S 和18 S 两条带是否清晰，有无降解，以及是否有DNA污染。

取1 μl RNA样品溶于99 μl DEPC处理过的双蒸水中，用酶标仪测定在260 nm和280 nm波长处的吸光度。以A260值计数其浓度，1个A260单位=40 μg/ml RNA。计算公式：质量浓度（μg/ml）=A260×40×100（倍数）。

以A260/A280的比值表示其纯度，比值在1.8～2.0 为纯的核酸；比值低于1.8，说明RNA 样品有蛋白质或酚污染，需用氯仿重新抽提。

1.4.4 荧 光qRT-PCR 检 测FLS 的IL-1β 和TNF-α mRNA基因变化

利用promega 反转录试剂盒反转录总RNA 为cDNA[15]，梯度PCR仪优化选定PCR退火温度。条件优化后进行IL-1β和TNF-α mRNA表达分析，复管，重复5次。PCR反应体系：2×反应混合物10 μl，消毒水7 μl，引物0.5 μl，cDNA 2 μl。PCR 条件：95℃10 s 变性，退火温度[13]，59.0℃15 s退火，40个循环。55.0℃～95.0℃观察溶解曲线。引物序列，参考文献[16-18]并通过美国生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information,NCBI）的Primer-Blast 比 对大鼠基因序列，完全正确。IL-1β mRNA（Forward：5′-CCTTGTGCAAGTGTCTGAAG-3′，Reverse ：5′-GGGCTTGGAAGCAATCCTTA-3′）；TNF-α mRNA（Forward：5’-CAAGGAGGAGAAGTTCCCA-3′，Reverse：5′-TTGGTGGTTTGCTACGACG-3′）；GAPDH mRNA（Forward：5′-TCTTCCAGGAGCGAGATCCC-3′，Reverse：5′-TTCAGGTGAGCCCCAGCCTT-3′）。

1.5 蛋白质的提取及其浓度、纯度和化学完整性鉴定

将TRIzolTM法提取RNA 途中留存的样品，加入100 μl 100%乙醇混匀充分，室温孵育3 min，2000×g，4℃离心5 min，吸取上清至新管中，加入600 μl 异丙醇，混匀，室温孵育10 min，12 000×g，4℃离心6 min，弃上清，加入800 μl 0.3 mol/L 盐酸胍，95%乙醇重悬沉淀。室温孵育20 min，6000×g，4℃离心5 min，弃上清。重复重悬沉淀两次后，加入800 μl 100%乙醇混匀充分，室温孵育20 min，6000×g，4℃离心5 min，弃上清，空气干燥，5～10 min。每管加入200 μl 的1%SDS 在50℃水浴锅中使沉淀充分溶解。10 000×g，4℃离心10 min，收集上清液到新试管中。详细的TRIzolTM提取蛋白质法按Invitrogen 的用户指南介绍的方法加以改进进行。常规提取培养细胞蛋白质方法按《分子克隆》介绍的用裂解缓冲液提取。

蛋白质浓度测定采用紫外光谱吸收法[19]，蛋白质溶液在波长280 nm 附近由于酪氨酸、色氨酸残基有强烈的吸收。据此运用以下公式计算蛋白质含量：蛋白质含量（mg/ml）=F×（1/d）×A280，此处F 可查表，d为测量杯光径（cm）。

蛋白质纯度评估采用测定纯化蛋白质的紫外光谱确定[20]。以A280/A260的比值表示其纯度。比值在1.8～2.0为纯的蛋白质；否则怀疑有核酸污染。

蛋白质化学完整性和生物反应能力检测：采用考马斯亮蓝凝胶染色液染色SDS-PAGE结果，观察蛋白质有无降解[21]；确定无降解后，采用免疫印迹法检测FLS的功能蛋白IL-1β和TNF-α表达情况，鉴定所提蛋白质的质量。免疫印迹法具体操作步骤参考文献[22,23]。

1.6 统计学方法

采用SPSS 17.0软件进行统计分析。免疫印迹检测结果采用相对光密度值表示，荧光qRT-PCR检测结果采用2-△△CT表示。数据以均数±标准差表示。两组间比较采用t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 原代滑膜细胞的培养、纯度和增殖

采用腹腔注射1.5%戊巴比妥钠麻醉SD大鼠，剂量为2 ml/（kg·bw）。75%乙醇浸泡大鼠10～20 min，取双侧后膝关节（图1A、1B）。分离的滑膜组织培养1 d 后，细胞绝大部分为梭形（图1C）。培养第6 天（图1D），细胞融合度达70%～80%，贴壁生长，但是仍然有极少的圆形、椭圆形细胞，进行传代。培养第12～14 天（图1E），第3 代细胞形态为梭形，核位于中央，生长良好。第8 代滑膜细胞增长缓慢，形态从梭形变为近似椭圆形，细胞间隙增大，有空泡、坏死、老化（图1F）。第3 代FLS，免疫荧光化学（图1G）和免疫组织化学染色（图1H）观察：形态规则，呈梭形，其细胞核为卵圆形位于细胞中央；波形蛋白（vimentin）染色滑膜细胞阳性率大于98%，vimentin为FLS特征性标志蛋白，提示培养的滑膜细胞为FLS；观察第3～7代的FLS，增殖活跃，生长情况良好，从形态和特异性蛋白定位看为FLS，且纯度高。通过对原代培养的第7代滑膜细胞的5-乙炔基-29-脱氧尿苷（5-ethynyl-29-deoxyuridine,EdU）增殖实验，显示仍有增殖能力（图1I）。

图1 SD大鼠正常滑膜细胞原代培养及其鉴定

综上，滑膜细胞原代培养的第3～7代FLS可作为后续实验研究材料。

2.2 RNA的完整性、得率、纯度[24]

用AGPC和TRIzolTM法提取的RNA[25,26]进行甲醛琼脂糖凝胶电泳，18 S 带和28 S 带清晰可见，且28 S带比18 S带亮度强2～3倍，带与带之间无明显拖尾现象，表明RNA 无降解，无明显的DNA 污染（图2A），RNA 样品A260/A280的比值均在1.8 以上，说明RNA 未被蛋白质、酚污染，是高纯度的。RNA 的最低浓度1.4 μg/μl，含量18.5 μg以上/5×105细胞，达到了AGPC和TRIzolTM法提取RNA的标准。用此RNA可进行多次qRT-PCR 分析，若用于耗RNA 量较大的Northern印迹法，也可满足2次以上。

qRT-PCR分析IL-1β 和TNF-α mRNA表达，获得成功。AGPC 和TRIzolTM法提取的FLS 总RNA 进行功能基因IL-1β 和TNF-α 表达分析，二者的2-△△CT值无明显差别（图2B）。

荧 光qRT-PCR 检 测FLS 的IL-1β、TNF-α 和GAPDH mRNA 结果显示：扩增曲线均成S 趋势，溶解曲线一致，无杂峰。图2C、D 显示的是TRIzolTM法提取的总RNA 进行IL-1β 的qRT-PCR 分析所得的扩增曲线和溶解曲线。

图2 AGPC和TRIzolTM法所提FLS总RNA的甲醛琼脂糖凝胶电泳及IL-1β和TNF-αmRNA表达情况

2.3 蛋白质的得率、纯度[24]和生物反应能力

用SDS 裂解缓冲液和TRIzolTM试剂提取的蛋白质[27]，进行SDS-聚丙烯酰胺不连续凝胶电泳后，用考马斯亮蓝染色液染色凝胶，显示分离效果好，无降解蛋白肽段（图3A）。

通过测定蛋白质在波长280 nm 处吸收值，两组方法得出总蛋白质80 μg以上/5×105细胞，完全可以满足2～3次免疫印迹分析需要。两种方法所提蛋白质样品的A280/A260比值均在1.8以上，表明蛋白质纯度达标。

免疫印迹法对IL-1β 和TNF-α 蛋白分析结果显示：目的蛋白条带均一，背景干净，无杂带（图3B），这说明蛋白肽段完整性好，可与抗体有效结合，具有生物反应能力。

图3 SDS-裂解和TRIzolTM法所提FLS总蛋白电泳分离后的考马斯亮蓝染色的凝胶图像及IL-1β和TNF-α蛋白表达情况

3 讨论

细胞原代培养技术是广泛用于分子生物学体外研究的重要方法之一，但多数实验室细胞原代培养的成功率不高，纯度不够，有稳定的母系细胞特征和功能的传代细胞的代数较少。如何成功培养出原代细胞并建立从其培养出的有母系细胞特征和功能的少量原代细胞中提取所需的RNA 和蛋白质尤为重要。因此，建立原代培养方法和从同一份原代培养细胞中同时提取核酸蛋白的方法很有必要。本研究经过多次实验，成功地培养出有FLS生理功能的原代滑膜细胞，FLS纯度在98%以上，且原代培养细胞的第3～7代均可作为后续实验研究材料[13]。在此基础上，运用TRIzolTM试剂盒成功建立了从同一份原代培养细胞中同时提取总RNA和蛋白质的快速提取法。RNA和蛋白质的纯度、完整性和生物学行为功能完全达标，试剂来源容易，操作简便，适用于国内实验室。

本研究对分离出的SD大鼠膝关节滑膜组织采用Ⅰ型胶原酶消化法进行原代培养，严控操作细节，获得具有FLS 生理功能的原代细胞。原代培养出FLS的成功关键是严控细节操作。整个过程在无菌和冰浴下操作，减少细胞污染和死亡；锐性分离滑膜组织要尽可能剪碎滑膜组织，不要过滤，要磨平移液器吸头，减少细胞物理损伤和污染机会；传代消化终止后，重悬洗涤2次以上，减少胰酶对细胞的损伤；原代细胞进行传代时，融合度不能超过80%，防止细胞接触抑制、损害原代细胞的生物学行为和特征的稳定。

TRIzolTM试剂盒虽有从同一份标本中提取出RNA 和蛋白质的方法支持，但国内研究人员鲜有成功尝试的报道。本研究经过多次重复和探索实验，运用TRIzolTM试剂盒试剂，经过改良从同一份原代培养细胞标本中同时提取出RNA和蛋白质。与传统提取方法比较，两种方法提取的RNA 和蛋白质质量无差别。RNA和蛋白质的完整性和生物功能取决于最大限度地避免提纯过程中内源及外源性的核糖核酸酶和蛋白酶对RNA和蛋白质的降解。同时还要防止机械高温对RNA 和蛋白质的降解。为了确保所提RNA 和蛋白质的特征和功能，提取过程须在无菌和冰浴下操作，超声破碎细胞不能超过5 s×3次，每次间隔1 min，严防RNA和蛋白质受热和机械力持续而降解；RNA、DNA 和蛋白质的分相过程中，确保水相或管子处于无RNA酶状态，确保水相无RNA酶和蛋白质污染，吸取上清，宁少勿多；在100%乙醇去除中下层中的絮状DNA 时，吸取上清，宁少勿多，确保蛋白质的纯度；最后，在RNA 和蛋白质的洗涤过程中，尤其是蛋白质，离心力不宜太大，离心时间不宜太长，防止增加溶解RNA和蛋白质沉淀的难度。

传统方法提取RNA和蛋白质，多种试剂分别加入两份原代细胞，多环节操作，增加了RNA和蛋白质的污染和降解机会，从而增加了操作难度。把RNA和蛋白质放在同一份标本中提取，简化了操作步骤，可比性好。不但节省时间，提高了工作效率，而且减少了RNA和蛋白质降解的机会，无需单独提取RNA和蛋白质所需的RNA酶抑制剂和蛋白酶抑制剂。

4 结论

本研究建立的同时提取FLS原代细胞微量RNA和蛋白质的方法，操作简便，高效快速，经济实用。通过FLS总RNA 的0.8%变性甲醛凝胶电泳监测、实时荧光定量PCR对FLS的功能分子分析及FLS总蛋白质的SDS-PAGE监测、免疫印迹法实验印证功能分子表达，证明了同时提取的FLS 原代细胞RNA 和蛋白质纯度高、完整性好，具有母系细胞的生物学行为功能，完全适用于体外培养细胞的分子生物学研究，预示此方法将有良好的应用前景。本研究建立的提取方法，对除FLS 外的原代细胞的微量RNA 和蛋白质同时提取也有借鉴作用。

从FLS原代细胞中同时提取微量总RNA和总蛋白质，得率高、纯度好，具有化学完整性和生物反应能力，有利于体外细胞分子生物学研究。

【利益冲突】所有作者均声明不存在利益冲突