转谷氨酰胺酶改性大豆分离蛋白的溶解性研究

张志衡，王升楠，卢亚东，李玉娥，陈振家

（山西农业大学食品科学与工程学院，山西太谷 030801）

大豆不仅是一种优良的油料作物，更是一种理想的食用蛋白质资源，随着社会的进步与经济的发展，人们越来越强的健康意识促进了大豆相关食品市场的活跃，其中大豆分离蛋白（SPI）是大豆蛋白产品中极为重要的产品之一，大豆分离蛋白作为优质的植物蛋白质，蛋白浓度极高，营养成分均衡，富含人体必需的氨基酸，在机体内的消化利用率高，适当地添加可提高食品的蛋白功效比值。大豆分离蛋白亦具有良好的溶解性、起泡性、乳化性等功能特性，这些特性在食品加工中起着决定性作用[1]。因而对SPI 的深入研究至关重要。

由于当前SPI 在食品加工中某些功能特性的兼容性较差，且很难同时兼具多种功能，而生产上需求的却是专项最佳功能或兼具几种功能平衡的产品。因此，需对其进行改性处理。转谷氨酰胺酶（简称TG）是一种催化转酰基酶，它能催化蛋白质中赖氨酸上的ε-氨基与谷氨酸上γ-羟酰胺基之间发生联合反应，聚合蛋白多肽形成共价聚合物。而TG 酶交联能改变SPI 的溶解性、凝胶特性、疏水性等性质，利用TG 酶交联改性大豆分离蛋白，使SPI 的空间结构和功能特性得以改变，能够满足人们的生产要求[2]。如改性后蛋白产物中小分子肽组分含量高，比氨基酸蛋白质更易于被人体消化吸收；改性后的大豆蛋白具有更高的应用价值，可以拓宽SPI 在食品工业中作为配料应用的范围。国内外很多学者对TG 酶交联改性SPI 的功能特性已有一定的研究，但温度、pH、盐离子浓度对改性SPI 溶解性影响的研究却寥寥无几，再者，溶解性作为食品的主要功能特性，具有很重要的研究价值。本研究以脱脂豆粕为原料制备SPI 和MSPI，研究它们分别在不同温度、pH 和盐离子浓度下改性前后大豆分离蛋白的溶解性，并使用SDS-PAGE 电泳技术对改性后的大豆分离蛋白组分进行了亚基分析，探究改性前后大豆分离蛋白聚集特性的变化，旨在为改性大豆分离蛋白在食品中的应用提供一定的参考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料与试剂 大豆脱脂豆粕（购于金源粮油工业有限责任公司，蛋白质＞51%）；转谷氨酰胺酶、NaCl、考马斯亮蓝G-250、牛血清蛋白、无水乙醇、巯基乙醇、丙烯酰胺、甲双叉丙烯酰胺、SDS、溴酚蓝、过硫酸铵、低分子量Marker（14.4～97.4 ku）、四甲基乙二胺、Tris（分析纯）。

1.1.2 试验仪器 DYY-7C 型电泳仪（北京市六一仪器厂）；可见分光光度计（上海菁华科技有限仪器公司）；HH 系列数显恒温水浴锅、磁力加热搅拌器（金坛市科析仪器有限公司）；HC-2064 高速离心机、大容量低速离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司）；高剪切分散机（德国IKA 公司）；精密增力电动搅拌器（常州国华电器有限公司）。

1.2 试验方法

试验于2019 年12 月在山西农业大学食品科学与工程学院粮油实验室进行。

1.2.1 大豆分离蛋白样品的制备 将脱脂豆粕与水按1∶10（m∶V）比例混合，调pH 值至8.5，搅拌2 h 后纱布过滤，过滤液4 000 r/min 离心20 min，上清液调pH 值至4.5，静置15 min 后离心，水洗沉淀2 次；沉淀加水复溶至pH 值7.0 后，冷冻干燥后备用。

1.2.2 TG 酶改性大豆分离蛋白样品的制备 将脱脂豆粕与水按1∶10（m∶V）比例混合，调pH 值至8.5，搅拌2 h 后纱布过滤，过滤液4 000 r/min 离心20 min，上清液调pH 值至4.5，静置15 min 后离心，水洗沉淀2 次；沉淀加水复溶至pH 值7.0 后，加入0.5%（m酶∶m溶液）TG 酶，50 ℃水浴反应2 h，之后沸水浴5 min 灭酶。调pH 值至4.5，离心，弃上清液，沉淀水洗2 次，复溶至中性，冷冻干燥后备用。

1.2.3 溶解性单因素试验 将蛋白样品分散于蒸馏水中配制质量浓度为1%的溶液，在一定的温度下用恒温磁力搅拌器搅拌30 min，调整pH 值，称取一定质量的NaCl，并搅拌10 min 至溶解，取1 mL样品离心（10 000 r，10 min），适当稀释一定倍数，取100 μL 样品与5 mL 考马斯亮蓝溶液混合[3]，用分光光度计在595 nm 下测定可溶性蛋白质的含量。温度分别设为50、60、70、80、90、100 ℃共6 个水平，pH 值分别设为2、3、4、4.5、5、6、7、8、9、10、11、12 共12 个水平，盐离子浓度分别设为0、0.01、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mol/L 共13 个水平。

1.2.4 大豆分离蛋白组分SDS-PAGE 电泳 溶解度测定完成后，分别取上述不同处理蛋白样品中的上清液和底部沉淀制备电泳样品，上清液和沉淀的添加量不超过1 mg/mL（m蛋白：m电泳液），本试验要分析二硫键的变化规律，因此，需添加2%β 巯基乙醇作还原处理进行对比。SDS -PAGE 电泳采用LAEMMLI[4]的方法，制得的分离胶浓度为12%，浓缩胶浓度为5%，上样量5 μL，恒压电泳，电流为40 mA，浓缩胶电压为100 V，分离胶电压为150 V。电泳完毕，固定3 h 并染色，染色2.5 h 后脱色，然后用扫描仪进行扫描，并分析图谱。

1.3 数据分析

采用Microsoft Excel 2019 对数据进行分析，采用Orign 8.0 软件进行制图。

2 结果与分析

2.1 不同温度下MSPI 和SPI 溶解性的比较

由图1 可知，经TG 酶改性后的MSPI 溶解性明显下降。改性前后SPI 的溶解性在50～70 ℃内均增大，在70～100 ℃内随温度升高而下降。有研究表明[5]，蛋白质进行适当的热处理会出现离解和开链现象，增强了水合能力，溶解度增大。但是当温度达到70 ℃以上时，肽链结构发生变化，大量疏水性基团暴露在蛋白质表面并且蛋白质分子间互相缠绕，促进了蛋白质分子的聚集和沉淀，导致蛋白质溶解度下降，因此，在70 ℃时蛋白含量达到峰值。同时，因为在大豆分离蛋白交联过程中分子间或分子内发生共价交联，使小分子物质聚集成大分子物质，形成了以G-L 键连接的更加稳定的蛋白质网络结构，不易与水结合，因此，MSPI 的溶解性较SPI 低。

2.2 不同pH 值梯度下MSPI 和SPI 溶解性的比较

由图2 可知，在不同pH 条件下的MSPI 的溶解性明显低于SPI。SPI 和MSPI 曲线虽均呈先下降后上升趋势，但MSPI 的溶解性对pH 的敏感度较SPI 低。2＜pH＜4.5 时，溶解性均逐渐下降；4.5＜pH＜12 时，溶解性均逐渐上升，在等电点（pH 值4.5）附近时，SPI 和MSPI 的溶解性最差，究其原因是，蛋白质在等电点附近时，溶液正负电荷达到平衡，蛋白质分子间的排斥力很小，更容易形成大的不溶性聚集体，因此，溶解度最低；当远离等电点时，平衡被打破，在较酸或较碱环境下，蛋白质溶液带正电荷或负电荷，蛋白质分子间的排斥力增大，体系分散性越好，则溶解性越好。MSPI 溶解性明显低于SPI，原因是经过TG 酶改性后，大豆蛋白分子内或分子间形成了以共价键（G-L 键）连接的共聚物，使其蛋白质网络结构更加稳定，这与张海均[6]等的研究结果一致。

2.3 不同盐离子浓度下MSPI 和SPI 溶解性的比较

由图3 可知，在不同盐离子浓度下MSPI 的溶解性明显低于SPI；MSPI 和SPI 的溶解性随盐离子浓度的变化趋势相似，均呈先升高后降低的趋势，在盐离子浓度为0.05 mol/L 时，SPI 和MSPI 的溶解性最大。盐离子浓度大于0.05 mol/L 后，MSPI 和SPI 的溶解性逐渐降低，究其原因是，随着盐离子浓度的增加，盐离子大量中和蛋白质颗粒上的电荷，降低了蛋白分子间排斥力，从而使蛋白质颗粒更容易聚集形成沉淀析出，即盐析效应[7-8]。

2.4 不同温度下MSPI 上清与沉淀的电泳图谱

从图4 可以看出，在非还原电泳图谱中，MSPI上清液中的亚基主要分布在相对分子质量14.4～97.4 ku 之间，在此区间的亚基条带颜色随温度升高越来越浅，这与MSPI 在不同温度下溶解度的变化趋势相符。在还原电泳图谱中，上清液中的亚基主要分布在14.4～97.4 ku和大于97.4 ku，各泳道浓缩胶消失，AB-11S 亚基完全消失，说明这些亚基是通过二硫键连接形成的；各亚基条带的颜色随温度的升高逐渐加深，推测是由于AB-11S 亚基的断裂形成了这些新的亚基。

在非还原电泳图谱中，MSPI 沉淀中的亚基主要分布在66.2～97.4 ku和大于97.4 ku的区间。各泳道的浓缩胶和14.4～97.4 ku的亚基条带颜色随温度的增加逐渐变浅。在14.4～22、31～43 ku的亚基条带颜色非常浅。在还原电泳图谱中，大于97.4 ku的亚基条带颜色变浅，各泳道的浓缩胶消失，AB-11S亚基完全消失；各泳道亚基条带颜色随温度升高逐渐变浅，这对应了上清中的亚基变化规律；在31～43、14.4～22 ku的亚基颜色明显变深，推测是AB-11S 亚基断裂形成了这些新的亚基[9]。

2.5 不同pH 下MSPI 上清与沉淀电泳图谱

由图5 可知，3、4、5 泳道的亚基条带颜色很浅，说明在此区间蛋白溶解度很低，这与MSPI 在等电点附近的溶解性一致。在非还原电泳图谱中，MSPI上清中的蛋白亚基主要分布在43～97.4 ku和大于97.4 ku的区间。MSPI 的亚基条带对于pH 变化较为敏感，pH 值为3 时颜色较浅，pH 值2、11、12 时亚基条带颜色较深，pH 值在6～10 时，亚基条带的颜色随pH 值的升高逐渐加深。在还原电泳图谱中，相对分子质量在66.2～97.4 ku及大于97.4 ku的亚基条带颜色明显变浅，在14.4 及31 ku附近的亚基消失，在52～68 ku的AB-11S 亚基消失，说明这些亚基主要是通过二硫键形成；在31～43 ku的A-11S亚基和14.4～22 ku的B-11S 亚基颜色加深，推测是由于AB-11S 亚基断裂形成，这与DING 等[10]研究结果相符。

从图6 可以看出，无论是在非还原还是还原条件下，3、4、5 三条泳道的颜色最深，说明等电点附近沉淀中的蛋白含量最高，对应了图5 上清中蛋白溶解度，再次印证了等电点附近溶解度变化规律。在非还原电泳图谱中，MSPI 沉淀的亚基主要分布在43～97.4 ku，pH 值为3 时亚基条带颜色最浅，pH 值4 时颜色最深，pH 值在4～10 时，各亚基条带颜色随pH 增加越来越浅；与图5 相比，A-11S 亚基和B-11S 亚基的颜色在图5 中较深，在图6 中较浅，说明A-11S 亚基和B-11S 亚基主要存在于上清中，为可溶性单体。在还原电泳图谱中，AB-11S亚基和大于97.4 ku的亚基颜色明显变浅，说明这些亚基主要是通过二硫键连接形成；同样，pH 值在4～10 的亚基条带随pH 增加颜色逐渐变浅，在14.4～22 ku出现新的亚基，这可能是11S 蛋白亚基断裂形成的，与部分学者得出的结果一致[11]。

2.6 不同盐离子浓度下MSPI 上清和沉淀的电泳图谱

从图7 可以看出，在非还原电泳图谱中，MSPI的上清蛋白亚基主要分布在43～97.4 ku。随着盐离子浓度的增加，条带颜色逐渐变浅，说明随着盐离子浓度的增加，MSPI 的溶解度逐渐降低，这与图3 中MSPI 的溶解性变化曲线相符；不同盐离子浓度条件下，上清液中的蛋白亚基种类没有发生改变，说明盐离子浓度的变化不会改变MSPI 上清中的亚基分布。在还原电泳图谱中，各泳道浓缩胶消失，相对分子质量大于97.4 ku及43～97.4 ku的亚基除了α′和α亚基外颜色均变浅，AB-11S 亚基完全消失，说明这些亚基主要是由二硫键形成的；在31～43、14.4～22 ku的亚基颜色变深，在14.4 ku 附近出现新的亚基条带，推测是由于AB-11S 亚基断裂形成的，且随着盐离子浓度的增加，各浓度亚基条带的颜色基本一致。

从图8 可以看出，在非还原电泳图谱中，盐离子浓度为0.6 mol/L 时亚基条带颜色最浅，其余泳道的亚基条带颜色基本保持一致。对比图7 发现，在66.2～97.4 ku和大于97.4 ku的亚基在图8 中颜色加深，说明这些亚基主要是以不溶性聚集体的形式存在。在还原电泳图谱中，各泳道浓缩胶消失，AB-11S 亚基完全消失，大于97.4 ku的亚基条带颜色变浅，说明这些亚基主要是由二硫键连接形成的。在66.2～97.4、31～43、14.4～22 ku的亚基颜色明显变深，14.4 ku附近出现新的亚基，推测是AB-11S亚基断裂形成了这些新的亚基。同样是在盐离子浓度为0.6 mol/L 时，条带颜色最浅，其余泳道的条带颜色基本保持一致，整体比未加入β 巯基乙醇时的颜色更深。

3 结论与讨论

大豆分离蛋白经TG 酶交联后形成了以G-L键连接的更加稳定的蛋白质网络结构，因此，在不同温度、pH、盐离子浓度下，MSPI 的溶解性均低于SPI，在食品行业中可以用以改善因蛋白质溶解酸败而出现的食品问题，具有重要的研究价值。随着温度的升高，MSPI 的溶解度呈先上升后下降的趋势，在70 ℃时溶解度最高，80～100 ℃溶解度变化不大。MSPI 的溶解度随pH 值的增加呈先下降后上升的趋势且明显低于SPI，在pH 值4.5 即等电点时溶解度最低。MSPI 的溶解度在盐离子浓度大于0.05 mol/L时有着小幅度上升，后随盐离子浓度的升高而下降。本试验结果与大多数学者的研究结果相似，不足之处在于试验方法单一，还有待进一步研究。

从非还原状态下的MSPI 电泳图谱中可以明显看出，有6 条亚基：α′、α、β、AB、A、B 亚基。相对分子质量在14.4～22 ku 的B-11S 亚基在不同温度下主要是以可溶性粒子形式存在于上清液中；MSPI在等电点附近时主要以沉淀形式存在；盐离子浓度的增加不会改变MSPI 溶液中的亚基分布。在加入β 巯基乙醇后，AB-11S 亚基的二硫键断裂，生成其他新的亚基。本试验结果与部分学者的研究结果相似，不足之处在于试验存在一定的误差，可通过多次试验对试验结果进行检验来改善。