临床克雷伯菌属碳青霉烯酶三种检测方法的实验比较研究

白 倩，赵 雅,，王 林（.陕西中医药大学，陕西咸阳 7046；.西安市第一医院检验科，西安 7000）

克雷伯菌属属于肠杆菌科，是导致肺炎、菌血症、尿路感染以及创口感染的常见医疗相关感染病原菌，其多重耐药现象是世界公众卫生健康面临的紧迫挑战。碳青霉烯类抗生素是治疗多重耐药克雷伯菌属感染的首选用药，但随着临床上此类抗生素的不合理使用，碳青霉烯耐药克雷伯菌属所致感染不断增多[1]。我国碳青霉烯耐药机制最常见为产碳青霉烯酶，主要流行类型为KPC 型（肺炎克雷伯氏菌碳青霉烯酶）、NDM 型（新德里金属β-内酰胺酶）、IMP 型（亚胺培南水解β-内酰胺酶）以及VIM 型（维罗纳整合子编码β-内酰胺酶），第一种属于丝氨酸酶，后三种属于金属酶，分别由blaKPC，blaNDM，blaIMP和blaVIM基因编码[2]。碳青霉烯酶遗传和表型检测的相关研究有助于全球监测碳青霉烯耐药菌的多样性和流行性，且快速准确地检测碳青霉烯酶，能够帮助临床及时地制定有效的治疗方案以及实现对医院内感染的监控[3]。至今尚无一种方法能够快速、准确、简便、经济、全面地检测碳青霉烯酶，本文选取了实验室常见的三种检测方法，以聚合式酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）法为金标准，采用改良碳青霉烯酶灭活试验（modified carbapenem inactivation method,mCIM）+ EDTA 碳青霉烯酶灭活试验（EDTA-carbapenem inactivation method,eCIM）和GeneXpert法检测克雷伯菌属碳青霉烯酶或碳青霉烯酶基因，对这三种测试进行方法学比较，为临床和实验室选择适合的方法提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 收集2019年1月～2021年5月西安市第一医院及西安交通大学第一附属医院临床分离出的克雷伯菌属细菌，共计80 株，碳青霉烯类耐药菌株43 株，碳青霉烯类敏感菌株37 株，剔除同一病人重复菌株，菌株分离鉴定按《全国临床检验操作规程》要求执行。质控菌株为大肠埃希菌（Escherichia Coli）ATCC25922，肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1705，肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1706。所有菌株均使用菌株保存管于-80℃保存。

1.2 仪器与试剂 GeneXpert®Carba-R 全自动病原体快速检测系统及试剂盒（美国赛沛公司），基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪（德国布鲁克公司），Vitek 2 Compact 全自动细菌药敏分析仪（法国生物梅里埃公司），PCR 扩增仪（美国Bio-Rad公司），电泳仪（北京六一仪器厂）；胰蛋白胨大豆肉汤培养基（tryptic soy broth，TSB，海博生物有限公司），MH 培养基（康泰生物有限公司），EDTA，细菌DNA 提取试剂盒及Taq PCR Mix 预混液（上海生工生物有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 菌株鉴定及药敏实验：将冻存于-80℃冰箱菌株恢复至室温，使用接种环接种于血琼脂平板上，过夜孵育。使用质谱仪进行细菌菌种鉴定，Vitek 2 Compact 全自动细菌药敏分析仪进行药敏试验。

1.3.2 PCR 法检测耐药基因：采用细菌DNA 提取试剂盒提取受试菌全基因组DNA，引物参照文献[4]设计，交由生工生物有限公司合成，见表1。PCR 反应体系共25μl：DNA 模板1μl，上、下游引物各1μl，Taq PCR Mix 12.5μl，ddH2O 9.5μl。扩增产物通过1.5ml/dl 琼脂糖凝胶60V 电泳60min，最终在凝胶成像系统上观察结果。PCR 扩增阳性产物交由奥科生物有限公司进行双向测序，在NCBI数据网上（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi）进行blast 序列比对。

表1 碳青霉烯酶耐药基因PCR 引物序列

1.3.3 mCIM+ eCIM 试验检测耐药表型:将冻存的菌株复苏接种于血琼脂平板上，过夜孵育。每个样本取1μl 纯菌落分别加入装有2ml TSB 肉汤（mCIM试验）和含20μl 0.5mol/L EDTA 的2ml TSB 肉汤（eCIM 试验）的试管中，漩涡震荡混匀。每个试管加入10μg 美罗培南药敏纸片，确保肉汤浸没纸片，37℃空气孵育4h。使用大肠埃希菌ATCC 25922 与生理盐水配置0.5 麦氏浓度单位（1×108CFU/ml）的菌悬液，将菌悬液均匀涂布于MH 平板上。将TSB 肉汤中的美罗培南纸片用无菌棉签挤出多余水分，贴于已涂布有大肠埃希菌ATCC 25922 的MH平板上。倒置平板，37℃空气孵育18～24h。结果判断：mCIM 试验阳性：美罗培南抑菌圈直径6～15mm 或直径16～18mm，但抑菌圈内有散在菌落。mCIM阴性：抑菌圈直径≥19mm。eCIM 试验阳性：与mCIM 结果相比，抑菌圈直径之差≥5mm，则判定为产金属酶类碳青霉烯酶。eCIM 试验阴性：与mCIM 结果相比，抑菌圈直径之差≤4mm，则判定为产丝氨酸类碳青霉烯酶（mCIM 试验阴性则不对eCIM 试验结果进行解释）。

1.3.4 GeneXpert 检测耐药基因:使用一次性接种环挑取受试菌单个菌落，用生理盐水配置成0.5 麦氏浓度单位菌悬液，取10μl 菌悬液加入样本试剂内，漩涡震荡混匀后取1.7ml 混合液加入GeneXpert®Carba-R 检测试剂盒，使用GeneXpert®Carba-R 检测系统对blaKPC，blaNDM，blaIMP，blaVIM，blaOXA-48 耐药基因进行检测。

1.4 统计学分析 采用WHONET5.6 软件对受试菌分布及耐药情况进行统计分析。采用SPSS 25.0软件进行统计学分析，计数资料比较采用卡方检验。以PCR 检测耐药基因为金标准，计算mCIM+eCIM试验和GeneXpert 的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值。Kappa 值＞0.75（P＜0.05）说明一致性较好。

2 结果

2.1 PCR 耐碳青霉烯酶基因检出结果 经PCR 扩增测序后，43 株碳青霉烯耐药克雷伯菌属中，40株携带耐药基因，3 株未检出耐药基因。在NCBI数据库进行blast 比对，blaKPC-2 有30 株，blaNDM-5有4 株，blaNDM-1 有4 株，blaIMP-4 有2 株。主要检出为blaKPC-2。部分PCR 碳青霉烯酶基因扩增阳性结果见图1。37 株碳青霉烯类敏感克雷伯菌属均未检出耐药基因。

图1 耐碳青霉烯类克雷伯菌属细菌blaKPC，blaNDM，blaIMP基因PCR 扩增产物电泳图

2.2 mCIM 和eCIM 试验结果 见表2。40 株碳青霉烯酶基因阳性受试菌中mCIM 试验阳性40株，eCIM 试验阴性（丝氨酸酶阳性）30 株，eCIM 试验阳性（金属酶阳性）10 株。3 株未检出碳青霉烯酶基因的耐碳青霉烯克雷伯菌属mCIM试验均为阴性。37 株碳青霉烯酶敏感克雷伯菌属mCIM 试验均为阴性。

2.3 GeneXpert 检测结果 见表2。40 株碳青霉烯酶耐药基因阳性受试菌中GeneXpert 共计检出38 株携带碳青霉烯酶基因，分别为27 株携带blaKPC，8 株携带blaNDM，2 株携带blaIMP，1 株携带blaKPC+blaNDM。3 株未检出碳青霉烯酶基因的耐碳青霉烯克雷伯菌属GeneXpert 检测结果均为阴性。37株碳青霉烯酶敏感克雷伯菌属GeneXpert 检测均为阴性。

表2 三种检测方法结果比较

2.4 三种方法检测碳青霉烯酶差异及方法学比较 以PCR 法为金标准，mCIM+eCIM 试验检测丝氨酸酶及金属酶表型结果灵敏度、特异度以及阴、阳性预测值均为100%，一致率100%，Kapaa 值为1。GeneXpert 检测敏感度为94.9%，特异度为97.6%，阳性预测值为97.4%，阴性预测值为95.2%，一致率96.3% Kappa 值为0.925。三种方法检测碳青霉烯酶差异及各自优缺点见表3。

表3 三种检测方法特点比较

2.5 碳青霉烯耐药克雷伯菌属细菌药敏结果分析43 株耐碳青霉烯克雷伯菌属细菌中检出携带碳青霉烯酶基因的有40 株，其余三株为非产碳青霉烯酶机制导致的碳青霉烯耐药。43 株耐药菌对亚胺培南、美罗培南的耐药率分别为97.7%（42/43）和100%（43/43），呈现高度耐药现象，未有对多黏菌素耐药菌株检出。三种不同基因型药敏实验结果见表4，对blaKPC及blaNDM两种基因型进行耐药率比较分析，结果显示blaKPC对阿米卡星的耐药率高于blaNDM（P＜0.05），blaNDM对米诺环素耐药率明显高于blaKPC（P＜0.05）。

表4 43 株碳青霉烯耐药克雷伯菌属常用抗生素耐药率（%）

3 讨论

1985年以来，碳青霉烯类抗生素一直是治疗多重耐药革兰阴性杆菌感染的首选治疗药物。但随着耐碳青霉烯肠杆菌（carbapenem-resistantEnterobacteriaceae，CRE）出现及全球传播，其多重耐药趋势以及血流感染期间高死亡率特征，已经成为一个日益严重的公共卫生问题[5-6]。在碳青霉烯耐药机制中，产碳青霉烯酶最为重要，编码碳青霉烯酶的基因通过可移动遗传元件实现耐药基因在菌株或菌种之间的水平传播，含碳青霉烯酶基因的质粒可以通过recA基因在细菌细胞内形成质粒多聚体，导致碳青霉烯耐药性的增加[7-8]。研究表明产碳青霉烯酶耐药菌比非产酶耐药菌毒性和传播力更强，且需要实施更多的感染控制干预措施[9-10]。因此，探究更快更准确地检测碳青霉烯酶方法对指导临床用药以及控制耐药菌株的产生与传播至关重要。本研究发现mCIM+ eCIM 试验与GeneXpert 检测碳青霉烯酶与PCR 法结果高度一致。

传统PCR 方法作为检测碳青霉烯耐药基因的金标准，需要设计特定引物。若待测基因与靶基因不符、待测基因拷贝数太低以及引物突变会导致假阴性结果，本研究有三株临床药敏实验结果显示碳青霉烯耐药，但未检测到碳青霉烯酶基因，可能是其他耐药机制引起的耐药或者本研究选择扩增的基因有限所导致。PCR 法对实验条件、设备及操作人员的要求较高，临床实验室难以常规开展，因此需要一种能够快速准确的检出碳青霉烯酶的方法[11]。

美国临床实验室标准化委员会（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）推荐的mCIM和eCIM 试验通过碳青霉烯酶水解美罗培南以及EDTA 能够抑制金属β-内酰胺酶活性的特点，即使待测菌株低水平表达碳青霉烯酶，mCIM 试验也能准确地检测出[12]。但目前mCIM 试验仅被推荐用于肠杆菌科细菌碳青霉烯酶的检测，在HOWARD等[13]人的研究中，mCIM 被用于检测不同革兰阴性杆菌是否产生碳青霉烯酶，结果显示mCIM 对产碳青霉烯酶铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌敏感度分别为74.1%和10.0%，对肠杆菌细菌的敏感度为96.2%。本研究与2018年CLSI 评价mCIM+ eCIM试验检测肠杆菌科细菌产丝氨酸酶和金属酶的敏感度、特异度结果相似。但有学者表明丝氨酸酶与金属酶共表达会导致eCIM 试验筛选金属酶的灵敏度降低，并且EDTA 对丝氨酸酶的抑制作用会导致结果仅表现金属酶阳性，因此当临床分离到高MIC值的肠杆菌科细菌时应注意是否为丝氨酸酶与金属酶共表达菌株[14]。mCIM 和eCIM 试验检测碳青霉烯酶以及区分表型具有较高的敏感度和特异度，经济学价值高、操作简单且结果易于判断[15]。但其检测周期长不能达到快速检测的目的，适用于基层实验室开展，不建议临床微生物实验室将其作为常规检查项目开展。

GeneXpert®Carba-R 试剂盒是由美国赛沛公司研发半巢式实时荧光定量PCR 技术，是一种自动化的体外检测试验，可以直接采用直肠拭子和临床分离株进行碳青霉烯耐药基因检测，试剂盒内含有多对引物，涵盖了在中国流行的主要碳青霉烯类耐药基因（包括blaKPC，blaNDM，blaIMP，blaVIM以及blaOXA-48），最新版本的检测试剂盒对blaOXA-48 的变异体blaOXA-181 和blaOXA-232 亦有着很好的检出率[16-17]。本研究中采用临床分离株进行检测，主要涉及blaKPC，blaNDM，blaIMP三种基因型的检测，与参考方法相比一致程度高。最近有人将GeneXpert技术直接用于深部痰标本中筛选肠杆菌科细菌基因，结果显示其对blaKPC和blaNDM两种基因型的灵敏度较高，有望成为直接在已知存在blaKPC和blaNDM型耐药菌感染风险的痰标本中检测和鉴定肠杆菌科细菌的潜在工具[19]。但这种检测方法的局限性是不能检测到新出现的或罕见的碳青霉烯酶基因，对于疑似产生碳青霉烯酶的菌株和阴性试验结果，应在参考实验室进一步评估是否存在碳青霉烯酶基因[20]。与其他两种方法相比，GeneXpert 这种分子方法具有更快地识别所涉及的耐药基因、能够允许迅速开始适当治疗的优势[21]。

综上所述，快速准确地检测出产碳青霉烯酶细菌对于优化抗生素管理、控制感染、改善预后、减缓耐药菌的发展至关重要。临床实验室可以将GeneXpert 技术作为快速检测碳青霉烯耐药基因的首要选择，为危急患者争取宝贵的时间。