黄芪-知母药对对肺纤维化大鼠的抗炎作用及机制研究

2022-03-30郑东梅王星晨张莹刘星星刘雪英王庆伟陕西中医药大学药学院陕西咸阳7206空军军医大学药学系药物化学教研室西安70032西安秦皇医院西安70600西安培华学院西安7025

中南药学 2022年2期

郑东梅，王星晨，张莹，刘星星，刘雪英，王庆伟，3*（. 陕西中医药大学药学院，陕西咸阳7206；2. 空军军医大学药学系药物化学教研室，西安 70032；3. 西安秦皇医院，西安 70600；. 西安培华学院，西安7025）

肺纤维化（pulmonary fibrosis，PF）是肺脏损伤后常见的病理过程，目前研究认为肺纤维化不可逆，严重者可引起呼吸衰竭。中医将肺纤维化归属为“肺痿”范畴，肺痿以气虚为根本病机，病证以痰、热最为多见，病位在肺、胃，可累及脾肾，病理上肺脾肾三脏病变可互相影响；现代医学认为，纤维化类疾病均表现为细胞外基质的沉积，其生物过程包含某些炎性细胞、纤维化因子、炎症因子及相关蛋白参与的关键通路等。

黄芪，归脾、肺经，可补肺脾之气，生津止渴。知母，归肺、胃、肾经，可滋肾阴，润肺燥，泻肾火。近代医家张锡纯所著的《医学衷中参西录》中记载黄芪、知母常作为药对配伍的方剂有玉津汤、升陷汤、理郁升陷汤及速降糖煎Ⅱ号，现代药学专著《施今墨对药》《中药药对大全》均收录了黄芪-知母药对。在黄芪-知母药对有效成分含量的测定中，陈沛鑫等发现，与单味药相比，两者同比例配伍时更有利于成分溶出与转化。研究发现，黄芪-知母同比例配伍常用于治疗肺病，在新型冠状病毒肺炎中也有应用，但其作用机制尚不明确。肺部疾病常伴随着炎症的产生，慢性炎症可进一步发展为肺纤维化，严重者甚至发展为肺癌。基于此，本实验拟采用博来霉素诱导大鼠肺纤维化，初步研究黄芪-知母药对（1∶1）对肺纤维化的抗炎作用，并探讨其机制，为中药的临床应用及二次开发提供参考。

1 材料

1.1 实验动物

SPF级健康雄性SD大鼠62只，体质量（200±20）g [空军军医大学实验动物中心，实验动物生产许可证号：SCXK（军）2015-006]。

1.2 试药

黄芪、知母均购于西安天晟中药饮片公司，经陕西中医药大学白吉庆教授鉴定，黄芪为豆科植物蒙古黄芪

Astragalus membranaceus

（Fisch.）Bge.

var. mongholicus

（Bge.）Hsiao的干燥根；知母为百合科植物知母

Anemarrhena asphodeloides

Bge的干燥根茎。

称取黄芪、知母药材，每份约3 kg，6倍量80%乙醇加热回流提取，每次2 h，合并醇提取液，旋蒸，浓缩，减压回收乙醇，得黄芪浸膏1.335 kg，浓缩至每克提取物相当于原药材1.972 g；得知母浸膏1.686 kg，浓缩至每克提取物相当于原药材1.532 g，置4℃冰箱冷藏备用。

注射用盐酸博来霉素（H 20055883，瀚晖制药有限公司）；苏木精伊红（HE）染色液（G1005，武汉谷歌生物科技有限公司）；Masson染色套装（G1006，Servicebio）；转化生长因子-

（TGF-

）试剂盒、肿瘤坏死因子-

（TNF-

）试剂盒、白介素-10（IL-10）试剂盒（江苏酶免有限公司）；核转录因子-

B p65（NF-

B p65）抗体（AF5006）、

-平滑肌肌动蛋白（

-SMA）抗体（AF1032）（Affinity公司）；TNF-

（ER 1919-22）、GAPDH抗体（ET 1601-4）（华安生物有限公司）；HRP标记山羊抗兔抗体（GB 23303）、组化试剂盒DAB显色剂（G1211）（Servicebio公司）。

1.3 仪器

xn300血细胞分析仪（希斯美康）；全自动酶标仪（美国Bio-Rad公司）；RM2016病理切片机（上海徕卡仪器有限公司）；Nikon Eclipse E100型正置光学显微镜、Nikon DS-U3型成像系统（日本尼康）；XSP-C204型显微镜（CIC）；TANON-5200型全自动化学发光图像分析系统（上海天能科技有限公司）。

2 方法

2.1 造模、分组及给药

健康SD雄性大鼠62只，适应性喂养1周后，随机选取52只，腹腔注射20%乌拉坦（5 mL·kg）进行麻醉，在大鼠颈部剪1 cm小口，钝性镊子逐层分离颈部肌肉，直至暴露气管，用1 mL注射器缓慢注入博来霉素（5 mg·kg），注入后立即将大鼠直立并左右旋转，使药液在肺内均匀分布，建立大鼠纤维化模型。取剩余同批次大鼠10只，作为正常组。造模2周后，随机选取经博来霉素处理过的大鼠2只处死，取肺组织行HE和Masson染色，观察到有大量炎性改变和胶原生成，确定肺纤维化模型复制成功。造模成功后，取剩余的50只大鼠，运用随机数表法将其分为模型组、醋酸泼尼松组、黄芪组、知母组、黄芪-知母药对组，每组10只。正常组给予0.5%的羧甲基纤维素钠（CMC-Na）水溶液灌胃；模型组造模后予以0.5%的CMC-Na水溶液灌胃；醋酸泼尼松组给予醋酸泼尼松3 mg·kg；黄芪、知母给药剂量参照《中药药理与实验方法》中人与大鼠表皮面积换算，分别为0.6846 g·kg和0.8812 g·kg；黄芪-知母药对组给药剂量以黄芪、知母生药量计算。所有药物均用0.5%的CMC-Na配制成溶液，每日给药一次，每次5 mL·kg，连续给药28 d。

2.2 取材

末次给药后，大鼠禁食不禁水12 h，腹腔注射20%乌拉坦（5 mL·kg）麻醉，颈总动脉取血用于外周血细胞检测。取肺组织，水洗，滤纸吸干，称定质量，左侧肺叶固定于4%多聚甲醛，右侧肺叶于冻存管－80℃冰箱备用。

2.3 HE染色观察肺脏病理学变化

各组大鼠左侧部分肺组织制成石蜡切片，将脱蜡水化的切片进行苏木精染色，盐酸水溶液分化，氨水水溶液返蓝，伊红染色，脱水，封片，观察肺脏炎性细胞浸润，肺泡腔内有无渗出物，有无充血水肿改变等，并采用Image J软件对炎性细胞的蓝色阳性染色进行相对定量分析，通过计算炎性细胞阳性面积和阳性区域进行定量。

2.4 Masson染色观察肺脏胶原沉积程度

Masson染色按照试剂盒依次操作，左侧肺组织切片脱水，封片，观察肺泡结构及纤维结节，胶原沉积情况，并采用Image J软件对胶原纤维的蓝色阳性染色进行相对定量分析，通过计算胶原纤维阳性面积和阳性区域进行定量。

2.5 ELISA试剂盒测定大鼠血清中TNF-α、IL-10、TGF-β1水平

将冻存的血清样本梯度放入－20℃和4℃解冻，试剂盒平衡到室温，按照ELISA试剂盒说明书步骤加样，温育，洗板，检测血清中TNF-

、IL-10、TGF-

含量变化。

2.6 免疫组织化学法检测NF-κB p65、TNF-α、α-SMA蛋白阳性表达

石蜡切片脱蜡、水化后，枸橼酸抗原修复缓冲液中进行抗原修复，置内源性过氧化物封闭液室温避光孵育25 min，3%BSA室温封闭30 min；加

-SMA（1∶1000）、TNF-

（1∶100）、NF

B p65（1∶600）一抗，4℃孵育过夜；加二抗（1∶200），室温孵育50 min；DAB显色；苏木素复染、脱水封片，阳性表达呈棕黄色或深棕。

2.7 Western blot法定量检测NF-κB p65、TNF-α、α-SMA蛋白表达

将右侧肺组织剪碎，在冰上匀浆，加入裂解液裂解30 min，10 000 g·min，4℃离心10 min，取上清液进行蛋白定量，调整蛋白量后，取等量裂解产物，加入上样缓冲液进行SDSPAGE电泳，电泳后转移至PVDF膜上，5%脱脂牛奶室温封闭1 h，加一抗，4℃孵育过夜，PBST洗涤，加二抗，室温孵育1 h，PBST洗涤，化学发光法显色，成像扫描分析系统保存图像。以GAPDH蛋白表达水平作为内参，以各样本与相应内参灰度值比值为蛋白相对含量。

2.8 统计分析

SPSS 25.0统计学软件进行分析，数据以±

表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-

检验，

＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 黄芪-知母药对对肺纤维化大鼠病理变化的影响

正常组大鼠肺泡结构清晰，无充血水肿结节现象；模型组大鼠肺泡间隔增宽，肺泡腔内充满分泌物及渗出物且大量炎性浸润（HE染色，见图1a），肺实变区胶原增生明显且聚集成块状（Masson染色，见图1b），炎症相对面积显著增高（

＜0.01，见图2a），肺脏纤维化相对面积显著增高（

＜0.01，见图2b）。与模型组比较，醋酸泼尼松组大鼠肺组织水肿、充血不明显，肺脏损伤较为明显和炎性改变减轻，肺泡腔见少量纤维组织及炎性浸润，其炎症及纤维化相对面积均显著下降（

＜0.01）。黄芪-知母药对组大鼠肺泡结构较完整，肺泡腔内少量渗出物，纤维增生不严重，可见少量炎性浸润及纤维结节出现，其炎症及纤维化相对面积均显著下降（

＜0.05，

＜0.01）。单味黄芪、知母治疗后，肺泡结构基本完整，但肺泡腔内仍较多炎性浸润，纤维结节较多，与模型组相比，其炎症和纤维化相对面积均有下降，但差异无统计学意义（

＞0.05）。

图1 给药28 d后各组大鼠HE染色（a）和Masson染色（b）情况（×100，n＝3）Fig 1 HE staining（a）and Masson staining（b）of rats 28 days after the administration（×100，n＝3）

图2 各组肺纤维化大鼠肺脏炎性细胞（a）及纤维化面积（b）情况（n＝3）Fig 2 Relative area of pulmonary inflammatory cells（a）and fibrosis（b）of rat in each group（n＝3）

3.2 黄芪-知母药对对肺纤维化大鼠外周血炎性细胞数目的影响

与正常组相比，模型组大鼠外周血白细胞数（WBC）、中性粒细胞数（PMN）、单核细胞数（MO）、淋巴细胞数（LYM）、嗜酸性细胞数（EO）均显著升高（

＜0.01）。与模型组相比，醋酸泼尼松组WBC、PMN、MO、LYM、EO含量均显著降低（

＜0.05，

＜0.01）；黄芪-知母药对组WBC、PMN、MO、LYM显著降低（

＜0.05，

＜0.01）；黄芪、知母组WBC、PMN、MO、EO、LYM含量均有降低，但差异无统计学意义（

＞0.05），见图3。

3.3 黄芪-知母药对对肺纤维化大鼠血清中炎症因子含量的影响

与正常组相比，模型组大鼠血清TNF-

、TGF-

含量均显著升高（

＜0.01），IL-10水平显著降低（

＜0.01）。与模型组相比，醋酸泼尼松和黄芪-知母药对组大鼠血清TNF-

、TGF-

含量均显著降低（

＜0.05，

＜0.01），IL-10含量显著升高（

＜0.01）；知母组大鼠血清中TGF-

含量显著降低（

＜0.05）；黄芪组、知母组大鼠血清中IL-10含量均显著升高（

＜0.05），但TNF-

含量变化差异无统计学意义，见图3。

3.4 黄芪-知母药对对肺纤维化大鼠TNF-α、NF-κB p65、α-SMA蛋白表达的影响

与正常组相比，模型组大鼠肺泡区TNF-

、NF-

B p65、

-SMA蛋白阳性率及蛋白表达显著升高（

＜0.05，

＜0.01）；与模型组相比，醋酸泼尼松组与黄芪-知母药对组大鼠肺组织中TNF-

、NF-

B p65、

-SMA蛋白阳性率及蛋白表达显著下降（

＜0.05，

＜0.01）（见图4及图5）。

图5 黄芪-知母药对对大鼠肺组织中TNF-α、NF-κB p65、α-SMA蛋白表达的影响Fig 5 Effect of Astragalus membranaceus and Rhizoma Anemarrhenae couplet medicines on TNF-α，NF-κB p65，and α-SMA protein expression in pulmonary tissues of rats

4 讨论

肺纤维化是一种慢性、进行性、致命性的纤维化间质性疾病，发病率呈上升趋势。目前临床多采用激素、免疫抑制剂及肺移植手术等进行治疗，但有一定的不良反应及风险。近年来，中医药以多途径、多靶点、副作用少、疗效显著等特点成为肺纤维化疾病的替代疗法之一。肺纤维化疾病的发展可逐渐演变形成虚损性疾病，久之

患者肺脏损伤、消耗元气、肺虚失养，以致肺气闭郁、阴血亏耗，最终导致肺纤维化的发生。研究发现益气养阴法较常规的激素及免疫抑制剂治疗副作用更少，可改善患者肺功能、血氧饱和度，减缓肺纤维化进程。

研究发现，黄芪作为治疗肺纤维化使用频率较高的补益类药物，可通过调控TNF-

的生成，抑制NF-

B的活性来减轻肺组织炎症损伤，保持肺组织结构的完整。知母作为清热兼滋阴药，通过降低肺脏系数，提高肺脏、血清中肺表面活性物质相关蛋白表达，减轻气道及肺组织炎性细胞浸润，减少肺损伤。黄芪-知母作为经典药对之一，均归肺经，其中黄芪性温，味甘，可益气、升阳而固涩；知母性寒，味苦，滋阴、苦降而滑利，两者合用，一温一寒、一升一降、一收一散，达相辅相成之效，以此为基础的中药方剂清金益气汤已在临床广泛应用。已有研究表明，黄芪中总黄酮和皂苷类成分通过介导氧化应激和炎症反应干预博来霉素诱导的大鼠肺纤维化，其中总皂苷通过调控TGF-

/smad信号抑制早期纤维化结节的产生。研究发现，知母主要化学成分为皂苷和双苯吡酮类，知母皂苷BⅡ是皂苷类成分的代表，其可在mRNA和蛋白质水平上减少炎性细胞因子如IL-6及TNF-

的生成，且对核因子NF-

B的活性具有一定抑制作用。有研究通过网络药理学发现双苯吡酮类芒果苷通过结合关键蛋白靶点环氧合酶-2（COX-2），影响NF-

B炎症通路，从而发挥抗炎作用。另有学者发现炎症反应失控是导致纤维化发生的根源，也是促进肺纤维化病程进展的重要机制。肺脏发生纤维化后，肺脏组织细胞和相应免疫细胞释放大量炎性因子如TGF-

、IL-10、TNF-

，这些炎性因子相互作用，引发一系列级联反应，加重肺损伤。本实验通过测定肺纤维化大鼠外周血炎性细胞数和肺纤维化大鼠血清中TNF-

、TGF-

和IL-10的含量，发现黄芪-知母药对可调控炎性因子TNF-

、TGF-

和IL-10的水平，从而改善炎性损伤。本实验进一步观察了NF-

B炎症通路中TNF-

、NF-