CLCA4基因在头颈部鳞状细胞癌中的表达与其临床意义

张永红 刘雅丽

[摘要]目的 探讨CLCA4基因在头颈部鳞状细胞癌中的表达与其临床意义。方法 利用癌症和肿瘤基因图谱（TCGA）数据库，基于生物信息学检测CLCA4在头颈部鳞状细胞癌中的表达情况，通过分析网站中TCGA数据库的552例头颈部鳞状细胞癌患者（时间截止至2018年10月），绘制头颈部鳞状细胞癌中CLCA4在各种条件下的箱式图。并通过生存曲线、蛋白-蛋白相互作用网络（PPI）、基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）分析探讨CLCA4基因差异表达在头颈部鳞状细胞癌对患者产生的影响与重要性和判定差异基因主要影响的生物学功能或者通路。结果 CLCA4在头颈部鳞状细胞癌中表达显著下调（P<0.05），同时，CLCA4的低表达和较差的预后相关（P=0.01883）。PPI、GO和KEGG分析结果显示，CLCA4除了参与离子通道与表皮发育等调控，还发现其与免疫、炎性反应相关。结论 CLCA4在头颈部鳞状细胞癌参与免疫调节作用，提示头颈部鳞状细胞癌的免疫异常可能是影响患者生存率的关键，同时为头颈部鳞状细胞癌提供了全新的研究方向与思路。

[关键词]CLCA4；癌症和肿瘤基因图谱；头颈部鳞状细胞癌；免疫；炎性；大数据

[中图分类号] R739.91 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2019）5（b）-0017-04

[Abstract] Objective To investigate the expression and clinical significance of CLCA4 gene in head and neck squamous cell carcinoma. Methods The expression of CLCA4 in head and neck squamous cell carcinoma was detected by using TCGA database based on bioinformatics. A box diagram of CLCA4 in head and neck squamous cell carcinoma under various conditions was drawn by analyzing 552 head and neck squamous cell carcinoma patients （up to October 2018） in the cancer genome atlas （TCGA） database of website. The effects and importance of CLCA4 gene differential expression on patients with head and neck squamous cell carcinoma and the biological function or pathway of determining the main effects of different genes were discussed by survival curve， protein-protein interaction network （PPI）， gene ontology （GO） and Kyoto Encyclopedia of Gene and Genome （KEGG）. Results The expression of CLCA4 was significantly down-regulated in head and neck squamous cell carcinomas， and the low expression of CLCA4 was associated with poor prognosis （P=0.01883）. The results of PPI， GO and KEGG analysis showed that CLCA4 was not only involved in the regulation of ion channels and epidermal development， but also related to immune and inflammatory responses. Conclusion CLCA4 participates in the immunoregulation in head and neck squamous cell carcinoma， suggesting that the immune abnormality of head and neck squamous cell carcinoma may be the key factor affecting the survival rate of patients， and provides a new research direction and ideas for head and neck squamous cell carcinoma.

[Key words] CLCA4； The cancer genome atlas； Head and neck squamous cell carcinoma； Immunity； Inflammation； Big data

頭颈部鳞状细胞癌在全球范围内常见恶性肿瘤类型中位居第六[1]，其诱发头颈部鳞状细胞癌的发生的危险因素很多，其中包括吸烟、饮酒和环境、饮食因素[2]。虽然医疗界一直有新的治疗头颈部鳞状细胞癌的方法（如手术的改进），但是在过去30年内，头颈部鳞癌患者的5年总生存率仍然很低，并无明显改进[3]。有鉴及此，加深对头颈部鳞状细胞癌发病机制的了解是必须的而且很重要，故本研究选择从分子水平研究头颈部鳞状细胞癌的发生、发展，这样有利于发现新的分子靶点，并可以提供新的治疗手段与新思路。

1材料与方法

1.1头颈部鳞状细胞癌组织中CLCA4的信息提取

552例头颈部鳞状细胞癌患者组织样本来源于癌症和肿瘤基因图谱（the cancer genome atlas，TCGA）（https：//tcga-data.nci.nih.gov/tcga/），时间截止至2018年10月。下载并预处理头颈部鳞状细胞癌相关数据集的mRNA表达资料，在R语言安装edgeR包的条件下，分析CLCA4的表达情况。通过LinkedOmics（http：//www.linkedomics.org/）对头颈部鳞状细胞癌分析CLCA4基因。

1.2头颈部鳞状细胞癌组织中与CLCA4相关性最高的100个基因的富集分析

头颈部鳞状细胞癌中CLCA4相关基因则通过Spearman Correlation test计算，并以热图与火山图展示。利用在线网站Metascape（http：//metascape.org/）进行基因本体（GO）分析，京都基因和基因组百科全书（KEGG）富集分析。以判定预后基因主要影响的生物学功能或者通路。头颈部鳞状细胞癌中CLCA4的相关基因同样以上述方法进行富集分析。

1.3目标基因蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络图

利用在线网站Metascape（http：//metascape.org/）绘制与富集结果结合的PPI网络图，进一步查证富集与基因之间的关系。

1.4 头颈部鳞状细胞癌中CLCA4表达相关分析

利用LinkedOmics在线软件（http：//linkedomics.org/）对头颈部鳞状细胞癌中的CLCA4进行计算与分析，通过分析网站中TCGA数据库的552例头颈部鳞状细胞癌患者，绘制头颈部鳞状细胞癌中CLCA4在各种条件下的箱式图。

1.5统计学方法

统计学结果由LinkedOmics在线软件计算，变量之间的相关性采用Spearman相关性分析方法，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1 头颈部鳞状细胞癌中与CLCA4基因的相关性分析

通过TCGA分析，CLCA4在头颈部鳞状细胞癌中高度下调（P<0.05）。同时CLCA4的低表达和较差的预后相关（P=0.01883）（图1）。由于CLCA4在癌症中相关的报道不多，为了进一步获得CLCA4的相关信息，通过TCGA查找头颈部鳞状细胞癌中与CLCA4相关的基因，并通过Spearman相关性分析，并进行数据可视化，绘制火山图（图2）展示CLCA4与其他基因的相关系数，基因相关性以0点为分界线按区域进行划分，右区表示基因与CLCA4成正相关（P<0.05）（图2），左区表示基因与CLCA4成负相关（P<0.05）（图2），P值越小，表示该基因与CLCA4的相关性越高。

2.2 CLCA4在頭颈部鳞状细胞癌可能参与的调控相关因素

为了研究CLCA4在头颈部鳞状细胞癌可能参与的主要调控，按P值取与CLCA4相关性最高的头100个基因进行富集分析（图3，表1）。并结合PPI网络图联合分析（图4，见封四）。通过分析结果可以看出CLCA4在头颈部鳞状细胞癌中除了可能参与离子通道、表皮发育与细胞分化方面的调节之外，还与免疫相关，并且互相影响。

3讨论

肿瘤一直是人类未曾攻克的世界级难题，据大规模统计结果分析2014年全国范围内人群的恶性肿瘤发病率达到了235.23/10万（其中男性为268.65/10万、女性为200.21/10万），中标率达到184.58/10万，其中城市中标发病率为187.53/10万，农村地区中标发病率为181.10/10万[4]。头颈部鳞状细胞癌是世界第六大常见恶性肿瘤，在头颈部恶性肿瘤中，>90 %的病例均为鳞状细胞癌。根据大规模数据统计，全球头颈部鳞状细胞癌发病率为（10～15）/10万，占全身恶性肿瘤的16%～40%[5-6]，每年全球新增约500 000例头颈部鳞状细胞癌的患者[7]。我国 HNSCC 占全身恶性肿瘤的10%，2000 年我国每100 000人头颈部鳞状细胞癌的男、女年龄标准化发病率（age-standardized incidence rate per 100 000，ASR）分别为1.2%和0.7%，到2005年这个数字已上升为1.2%和0.8%[8]。

目前，通过计算机技术进行的生物信息学分析在肿瘤研究的各个方面有了广泛应用[9]，其中包括芯片分析和RNA测序在内的高通量分析筛选。CLCA4基因在多种癌症中都具有重要临床意义，但是目前并没有研究、讨论CLCA4在头颈部鳞状细胞癌中的作用与机制。在这项研究中，通过大数据分析，发现与正常组织比较，CLCA4的表达在头颈部鳞状细胞癌中被高度下调，这与其他癌症的文献报道趋势一致。此外通过此项分析还发现患者CLCA4低表达的预后较CLCA4高表达者差。

本研究通过挑选100个与CLCA4相关性最高的基因进行后续研究，进行富集与蛋白-蛋白相互作用网络分析，发现CLCA4在头颈部鳞状细胞癌中很可能参与免疫与炎性反应的调控，而免疫与炎性反应在癌症中具有重要意义[10-11]，与癌症关系密切，免疫与炎性反应在癌症中会极大地影响癌细胞的增殖、分化、存活、耐药、转移、侵袭力以及预后等相关问题，根据分析结果，可见CLCA4的下调与头颈部鳞状细胞癌中的免疫调节存在相关性。

目前对CLCA4在癌症中的研究集中在离子通道与表皮发育两方面[12-15]。有研究表明，CLCA4的过度表达极大地减弱了膀胱癌细胞的增殖、生长、迁移和侵袭能力，而CLCA4较低具有相反的作用[12-15]。此项数据分析除验证了文献中的结果外，还同时发现CLCA4可能参与调节自然杀伤细胞介导的免疫应答对抗原刺激的炎症反应。同时还观察到CLCA4可能参与外泌体的调节。癌细胞分泌的外泌体在癌症的发生及恶化过程中起着重要作用[16]。外泌体可促进癌细胞的增殖、扩散及帮助癌细胞逃离来自体内自身或者体外的清除机制[17]。在临床，癌细胞分泌的外泌体可以作为癌症诊断的分子标志物[18]。所以CLCA4具有重要的临床意义与价值。

综上所述，本次分析结果提示CLCA4不止是新的研究方向与研究靶点，同时还是非常有潜力的头颈部鳞状细胞癌生物标志物。希望此项研究结果可以为头颈部鳞状细胞癌的基础研究和临床实践提供进一步的理论指导，并希望可在日后继续对头颈部鳞状细胞癌基因进行更深入地研究与分析。

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（收稿日期：2018-11-22 本文編辑：许俊琴）