基于指纹图谱和网络药理学的木蝴蝶质量标志物预测分析

赵淼，包永睿，2，3，王帅，2，3，李天娇，2，3，孟宪生，2，3*（. 辽宁中医药大学药学院，辽宁 大连 6600；2. 辽宁省中药多维分析专业技术创新中心，辽宁 大连 6600；3. 辽宁省现代中药研究工程实验室，辽宁 大连 6600）

木蝴蝶来源于紫葳科植物木蝴蝶

Oroxylum indicum

（L.）Vent.的干燥成熟种子，始载于《滇南本草》，味苦、甘，性凉，归肺经、肝经，具有清肺利咽、疏肝和胃的功效，常用于治疗肺热咳嗽、喉痹、音哑、肝胃气痛等，主产于福建、台湾、广东、海南、广西、四川、贵州、云南等地。木蝴蝶主要含有黄酮及其苷类、挥发油及脂肪酸类、对羟基苯乙醇和环己醇及紫檀碱类化合物等，其中黄酮类是木蝴蝶的主要成分，现代药理学研究表明木蝴蝶具有抗菌、抗炎、抗氧化、抗肿瘤、降血糖等作用。

质量标志物（Q-Marker）是在溯源与传递性、特有性、可测性、有效性以及处方配伍这五项核心原则的基础上产生的，现已广泛应用于广藿香、南柴胡、甘草等中药及复方制剂的质量研究中，为中药及复方制剂中与临床作用相关的化学物质的研究提供了新思路。本实验在课题组前期研究的基础上，采用高效液相色谱法对木蝴蝶药材进行定性定量研究，并结合多元统计学方法，初步筛选出差异标志物，进一步利用网络药理学进行有效性分析，从化学和生物信息角度分析预测木蝴蝶的潜在Q-Marker，为木蝴蝶的质量控制及后续开发提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1260型快速高效液相色谱仪（美国安捷伦科技有限公司）；Sartorius CP225D电子分析天平（北京赛多利斯天平有限公司）；Poroshell 120 SB-C色 谱 柱（4.6 mm×100 mm，2.7 μm，美国安捷伦科技有限公司）。

1.2 试药

10批木蝴蝶药材，产地分别为湖南、安徽、福建、贵州、广东、广西、四川成都、四川眉山、云南昆明、云南丽江，编号为S1～S10，经辽宁中医药大学许亮教授鉴定为

Oroxylum indicum

（L.）Vent.的干燥成熟种子。木蝴蝶苷A（批号：111595-201604）、木蝴蝶苷B（批号：111915-201608）、黄芩素（批号：111595-200301）、白杨素（批号：111701-200503）、金丝桃苷（批号：1521-200204）、白杨素7-

O

-

β

-

D

-葡萄糖醛酸苷（批号：111701-200607）对照品（中国食品药品检定研究院，质量分数均大于98%）；乙腈、甲醇（色谱纯，德国Merck公司）；水（纯净水，杭州娃哈哈集团有限公司）。

2 方法与结果

2.1 基于“五原则”的木蝴蝶药材Q-Marker来源的文献分析

关于木蝴蝶药材的质量标准，2020年版《中国药典》仅规定了木蝴蝶苷B的含量限度，检测指标单一，难以体现木蝴蝶的整体质量。中药Q-Marker是刘昌孝院士提出的新概念，中药Q-Marker是存在于中药材和中药产品中固有的或加工制备过程中形成的、与中药的功能属性密切相关的化学物质，有助于进一步提升中药有效性-物质基础-质量控制标志性成分的关联度。本文通过文献整合，从传统药性及药效因素、化学成分特有性及可测性、体内代谢转化等方面对木蝴蝶的Q-Marker进行预测，为建立木蝴蝶药材的准确的质量评价标准和科学全面的质量控制方法提供依据。

2.1.1 基于传统药性药效的Q-Marker预测分析 药性理论与功效研究是中药临床应用的前提条件，可以从不同角度客观描述中药治疗疾病的机制与性能，因此可作为Q-Marker预测分析的依据之一。木蝴蝶味苦、甘，性凉，归肺经、肝经，苦能清热解毒，凉则燥湿泻火。现代研究表明，苦凉清热药在对抗炎性反应、抗过氧化损伤、抗炎性细胞因子等方面有良好的表现，其物质基础多以黄酮类、生物碱类为主。木蝴蝶入药始载于《滇南本草》，其能定喘，消痰，破蛊积，又能补虚，宽中，进食。后《本草纲目拾遗》记载其能治心气痛、肝气痛，下部湿热。而2020年版《中国药典》记录木蝴蝶具有清肺利咽、疏肝和胃的功效，可用于治疗肺热咳嗽、喉痹、音哑、肝胃气痛。木蝴蝶的清热止咳及保肝作用得益于其丰富的黄酮类成分，如木蝴蝶苷A、木蝴蝶苷B、黄芩苷、白杨素、黄芩素等。综上所述，木蝴蝶中的黄酮类成分是其发挥功效的物质基础，可作为木蝴蝶Q-Marker筛选的潜在成分。

2.1.2 基于化学成分特有性及可测性的Q-Marker预测分析 木蝴蝶中化学成分众多，主要包括黄酮及其苷类、挥发油及脂肪酸类、对羟基苯乙醇类、环己醇及紫檀碱类化合物等。其中黄酮及其苷类成分为木蝴蝶的主要有效物质，在抗炎、抗氧化、抗肝癌等方面表现出良好的生物活性。何民友等利用多反应选择性检测的方法对木蝴蝶配方颗粒中黄酮类指标性的代表成分（木蝴蝶苷A、木蝴蝶苷B、黄芩素、黄芩苷、白杨素、白杨素-7-

O

-

β

-

D

-葡萄糖醛酸苷）进行检测，该方法线性关系良好，回收率高，能够对木蝴蝶进行快速鉴别并有效检测化学成分含量；也有学者基于UPLC-MS/MS法测定不同产地木蝴蝶中10种黄酮类成分，发现不同产地的黄酮类成分在含量上存在差异。由此可知，木蝴蝶黄酮类可能与木蝴蝶有效性密切相关，且均可进行定量检测与分析，由此可作为Q-Marker的潜在成分。

2.1.3 基于体内代谢转化的Q-Marker预测分析 中药成分复杂多样，但其有效成分需要吸收入血、到达靶器官并作用于相应靶点后才能发挥药效。因此，分析给药后药物的代谢过程，筛选出药效成分，有助于阐明其药效物质基础并确定Q-Marker。张博崴考察了木蝴蝶黄酮类成分中黄芩苷元的肠道代谢动力学，发现口服给药后黄芩苷元在肠内有较高分布，1 h时含量为总给药量的87%，12 h时含量为总给药量的20%，远高于肠道药理活性的起效浓度。尹金妥研究发现木蝴蝶苷B在大鼠体内可通过羰基化，乙酰化水解为黄芩素和木蝴蝶苷A，进一步以苷元和单糖形式代谢。上述研究均表明，木蝴蝶黄酮类成分可作为木蝴蝶质量控制的重要指标。

2.2 木蝴蝶指纹图谱研究

2.2.1 色谱条件 使用Agilent Poroshell 120 SBC色谱柱（4.6 mm×100 mm，2.7 μm），流动相为乙腈（B）-0.1%甲酸水溶液（A），程序梯度洗脱（0～10 min，15%～57%B；10～15 min，57%～65%B），柱温30℃，进样量10 μL，检测波长270 nm，流速0.6 mL·min。

2.2.2 供试品溶液的制备 分别取各产地木蝴蝶药材，精密称定，按照木蝴蝶黄酮类成分最佳提取纯化工艺条件进行制备。取纯化物0.1 g，精密称定，置于50 mL量瓶中，用50%甲醇溶液稀释至刻度，过0.22 μm微孔滤膜，作为供试品溶液，4℃保存，备用。

2.2.3 混合对照品溶液的制备 取木蝴蝶苷A、木蝴蝶苷B、白杨素、白杨素7-

O

-

β

-

D

-葡萄糖醛酸苷、黄芩素、金丝桃苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成质量浓度分别为0.593、0.404、0.122、0.388、0.223、0.503 mg·mL的混合对照品溶液。

2.2.4 方法学考察

① 参照峰的选择：2020年版《中国药典》将木蝴蝶苷B作为评价木蝴蝶质量的指标性成分，其含量较高，色谱峰较稳定，故选择木蝴蝶苷B作为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。

② 精密度试验：取S1批次木蝴蝶供试品溶液，连续进样6次，记录色谱图。结果木蝴蝶的各共有峰相对保留时间

RSD

＜0.37%，相对峰面积

RSD

＜3.9%，说明仪器精密度良好。③ 稳定性试验：取S1批次木蝴蝶供试品溶 液，分 别 于0、4、8、12、24、48 h进 样 分析，记录色谱图。各共有峰的相对保留时间

RSD

＜0.22%，相对峰面积

RSD

＜4.0%，表明样品稳定性较好。④ 重复性试验：平行制备6份S1批次木蝴蝶供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进样，记录色谱图。各共有峰的相对保留时间

RSD

＜0.86%，相对峰面积

RSD

＜3.0%，表明方法重复性较好，符合指纹图谱要求。2.2.5 指纹图谱的建立与评价 取10批木蝴蝶药材，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，进样测定，记录色谱图。将10批供试品色谱图导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”（2012版），以S1为参照，采用多点校正法进行色谱匹配，中位数法生成叠加图谱及对照图谱R，共标定20个共有峰。结果S1～S10相似度依次为0.917、0.929、0.998、0.991、0.959、0.994、0.995、0.996、0.987、0.996，表明各批次木蝴蝶药材具有良好的一致性。经过与混合对照品溶液图谱的比对，指认了其中的6个色谱峰，分别为5号峰金丝桃苷、8号峰木蝴蝶苷B、13号峰木蝴蝶苷A、16号峰白杨素-7-

Oβ

-

D

-葡萄糖醛酸苷、18号峰黄芩素、20号峰白杨素。10批木蝴蝶指纹图谱叠加图见图1，共有模式及对照品图谱见图2。

图1 10批木蝴蝶药材指纹图谱叠加图Fig 1 HPLC fingerprints of 10 batches of Oroxylum indicum

图2 木蝴蝶指纹图谱共有模式图（A）及混合对照品色谱图（B）Fig 2 Chromatogram of reference fingerprint of Oroxylum indicum（A）and reference substances（B）

2.2.6 偏最小二乘法判别分析（PLS-DA） 采用PLS-DA对木蝴蝶20个共有峰进行分析，得分矩阵图和变量重要性投影预测结果分别见图3、4。模型拟合参数

R

＝0.792，

R

＝0.903，模型预测参数

Q

＝0.532，均大于0.5，可知该模型稳定，预测能力较好。图3显示木蝴蝶药材S1～S5聚为一类，S6～S10聚为一类，说明不同产地的木蝴蝶药材在成分上存在差异。

图3 10批木蝴蝶样品的PLS-DA得分图Fig 3 PLS-DA score plot for 10 batches of Oroxylum indicum

为更好地明确不同产地木蝴蝶药材中差异较大的物质，结合各变量的VIP（variable importance in the projection）值正态分布图（见图4），筛选出贡献较大的6个变量（VIP＞1），VIP值由大到小依次为18号峰（黄芩素）、16号峰（白杨素-7-

O

-

β

-

D

-葡萄糖醛酸苷）、8号峰（木蝴蝶苷B）、20号峰（白杨素）、13号峰（木蝴蝶苷A）、11号峰。这些成分在区分不同产地木蝴蝶时起到重要作用，是木蝴蝶的差异标志物。

图4 木蝴蝶药材的重要变量Fig 4 Important variables of Oroxylum indicum

2.3 网络药理学研究

木蝴蝶具有清肺利咽、疏肝和胃的功效，其主要活性成分为黄酮类化合物，包括木蝴蝶苷A、木蝴蝶苷B、黄芩素等成分，具有抗炎、抗氧化、抗肝癌等药理活性。本实验基于文献研究结合指纹图谱的可测性及可溯性，确定指纹图谱所指认的木蝴蝶苷B、木蝴蝶苷A、黄芩素、白杨素、白杨素-7-

O

-

β

-

D

-葡萄糖醛酸苷5个活性成分为候选化合物。2.3.1 活性成分靶点信息的收集 利用中药系统药理学数据库和分析平台TCMSP（http://tcmspw.com/tcmsp.php）、BATMAN-TCM（http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）、Uniprot（https://www.uniprot.org/）共得到木蝴蝶苷B、木蝴蝶苷A、黄芩素、白杨素、白杨素-7-

O

-

β

-

D

-葡萄糖醛酸苷5个候选化合物的63个作用靶点，本课题组研究表明前期木蝴蝶苷B具有促进肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞增殖和转移的作用，但未在数据库中搜寻到相关靶点，故仅对其余4个化合物进行后续分析。2.3.2 蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络的构建 将4个有效活性成分涉及的靶点基因导入STRING数据库获取蛋白-蛋白相互作用数据信息，选取最高置信度蛋白交互参数评分值（＞0.9），构建PPI网络。将得到的tsv格式文件导入Cytoscape软件，按照度值（degree）由大到小进行排序，见图5。排名前10的基因分别为

AKT1

、

TP53

、

FOS

、

HIF1A

、

PTGS2

、

CASP3

、

MMP9

、

NOS3

、

HSP90AA1

、

IL-4

，它们可能是木蝴蝶的关键靶点基因。

图5 蛋白-蛋白相互作用网络构建Fig 5 Construction of protein-protein interaction network

2.3.3 GO功能富集分析与KEGG通路富集分析

① GO功能富集分析：采用DAVID 6.8数据库（https：//David-d.ncifcrf.gov/home.jsp），以

P

＜0.05、FDR＜0.05作为筛选条件对上述63个作用靶点进行GO功能分析，共获得257条结果，其中生物过程（biological process，BP）占180个，细胞组成（cellular component，CC）占23个，分子功能（molecular function，MF）占54个，根据

P

值由大到小排序，取前20条结果，进行可视化分析，如图6所示。结果显示生物过程主要涉及到细胞凋亡、RNA聚合酶Ⅱ启动子转录、白细胞介素IL-18生物合成过程的正调控等；分子功能主要富集在氧化还原酶活性、转录因子活性、组蛋白激酶活性等；细胞组分主要富集在细胞核周围区域。② KEGG通路富集分析：利用DAVID 6.8数据库以

P

＜0.05、FDR＜0.05为筛选条件对上述63个作用靶点进行KEGG通路富集分析，结果共得到20个条目，如图6所示。主要涉及的通路有：癌症通路（pathways in cancer）、细胞凋亡通路（apoptotic signaling pathway）、PI3K-Akt信号通路（PI3K-Akt signaling pathway）、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）信号通路、HIF-1信号通路（HIF-1 signaling pathway）、乙型肝炎（hepatitis B）等，以上结果表明中药木蝴蝶具有多成分、多靶点的作用特点，能够通过调控多条通路达到治疗疾病的目的。

图6 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析Fig 6 GO functional enrichment analysis and KEGG pathway enrichment analysis

2.3.4 “活性成分-靶点-通路”网络构建与分析 本研究根据筛选得到的4个成分、63个靶点和20条通路，运用Cytoscape 3.7.1软件构建“成分-靶点-通路”网络图，结果见图7。以化合物、靶点蛋白、信号通路的连接度（degree）为参考，发现木蝴蝶苷A、白杨素、白杨素7-

O

-

β

-

D

-葡萄糖醛酸苷、黄芩素4个化合物连接度差异不大，均可能是木蝴蝶的活性成分，

AKT1

、

TP53

、

CASP3

、

MMP9

、

IL-4

可能是木蝴蝶活性成分作用于肿瘤、神经活性配体等信号通路潜在的关键作用靶点。

图7 木蝴蝶“活性成分-靶点-通路”网络Fig 7 Network prediction of compound-target-pathway of Oroxylum indicum

2.4 木蝴蝶药材Q-Marker的含量测定

2.4.1 对照品溶液的制备 精密称定木蝴蝶苷A、木蝴蝶苷B、白杨素、白杨素7-

O

-

β

-

D

-葡萄糖醛酸苷、黄芩素对照品，加入甲醇制得质量浓度为0.593、0.404、0.122、0.388、0.223 mg·mL的混合对照品溶液。

2.4.2 方法学考察

① 线性关系考察：精密称取“2.4.1”项下混合对照品溶液，用甲醇倍比稀释成系列对照品溶液，进样测定，以质量浓度为横坐标（

X

），峰面积为纵坐标（

Y

），绘制标准曲线，计算回归方程，结果见表1。

表1 5个指标性成分的线性回归方程
Tab 1 Linear regression equation for 5 labeled components

成分 回归方程 r 线性范围 /（mg·mL－1）木蝴蝶苷A Y＝4.201×103X＋27.27 0.9998 0.165～0.810木蝴蝶苷B Y＝2.967×103X －55.13 0.9992 0.158～0.725黄芩素 Y＝2.221×103X －35.57 0.9994 0.033～0.412白杨素 Y＝4.354×103X －49.48 0.9999 0.027～0.337白杨素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷 Y＝3.409×103X －13.09 0.9993 0.049～0.575

② 精密度试验：取S1批次木蝴蝶供试品溶液，连续进样6次，结果供试品溶液中木蝴蝶苷A、木蝴蝶苷B、黄芩素、白杨素、白杨素-7-

Oβ

-

D

-葡萄糖醛酸苷的峰面积

RSD

分别为2.1%、2.0%、0.69%、0.75%、1.9%，表明仪器精密度良好。③ 重复性试验：取S1批次木蝴蝶供试品溶液6份，进样测定，结果供试品溶液中木蝴蝶苷A、木蝴蝶苷B、黄芩素、白杨素、白杨素-7-

Oβ

-

D

-葡萄糖醛酸苷的峰面积

RSD

分别为2.1%、2.2%、1.4%、1.2%、1.8%，表明该方法的重复性良好。④ 稳定性试验：取S1批次木蝴蝶供试品溶液，分别于0、4、8、12、24、48 h进样测定，结果供试品溶液中木蝴蝶苷A、木蝴蝶苷B、黄芩素、白杨素、白杨素-7-

O

-

β

-

D

-葡萄糖醛酸苷的峰面积

RSD

分别为1.1%、1.8%、1.4%、1.5%、1.2%，表明木蝴蝶供试品溶液在48 h内稳定性良好。⑤ 加样回收试验：精密称取6份已知含量的S1批次木蝴蝶粉末，根据样品中各成分含量，按1∶1比例精密加入相应对照品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，进样测定，记录峰面积。计算供试品中木蝴蝶苷A、木蝴蝶苷B、黄芩素、白杨素、白杨素-7-

O

-

β

-

D

-葡萄糖醛酸苷的平均加样回收率分别为101.10%、98.88%、100.52%、99.93%、98.76%，

RSD

分别为0.87%、1.0%、0.82%、0.63%、0.51%，表明该方法回收率良好。2.4.3 样品测定 分别精密称取10批木蝴蝶样品，按照“2.2.2”项下方法的制备供试品溶液，进样测定，计算木蝴蝶苷A、木蝴蝶苷B、黄芩素、白杨素、白杨素-7-

O

-

β

-

D

-葡萄糖醛酸苷的含量，结果见表2。

表2 10批木蝴蝶样品含量测定结果(mg·g)
Tab 2 Content of 10 batches of (mg·g)

样品 木蝴蝶苷A 木蝴蝶苷B 黄芩素 白杨素 白杨素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷S1 28.36 15.09 11.85 0.98 10.16 S2 27.11 20.68 9.16 1.48 4.25 S3 25.66 22.60 7.52 0.24 1.62 S4 25.13 24.04 5.31 0.17 0.95 S5 26.82 20.29 9.43 2.25 2.70 S6 26.44 21.95 9.05 0.93 0.04 S7 25.09 23.00 6.23 0.32 0.61 S8 28.31 19.52 7.63 0.27 8.64 S9 27.12 20.53 5.87 0.06 7.49 S10 25.62 23.46 6.70 0.22 0.84

3 讨论

中药质量是临床疗效的保证，是中药产业发展的生命线，中药成分复杂、质量参差不齐，因此建立更加科学、全面的质量评价方法尤为重要。中药指纹图谱是一种综合的、可量化的鉴定手段，建立在中药化学成分系统研究的基础上，分析中药的化学成分类型，对中药进行整体质量控制；网络药理学通过构建“疾病-基因-靶点-药物”作用网络，预测中药主要作用通路及靶点，并进一步阐释中药的作用机制，从理论上证明了中药成分的有效性；Q-Marker是可以定性定量的特有性化学成分，能够将中药有效性-物质基础-质量控制标志性成分相关联，解决在中药有效性基础上的中药质量评估问题。

本研究采用指纹图谱和网络药理学相结合的方法分析预测木蝴蝶的Q-Marker。首先通过查阅文献初步锁定木蝴蝶Q-Marker的来源范围为黄酮类化合物，临床研究表明黄酮类化合物具有抑菌、抗肿瘤、降血糖的功效，用于改善糖尿病、心血管疾病和肿瘤等多种疾病。通过建立木蝴蝶的指纹图谱从传递和溯源性的角度对木蝴蝶进行分析，认为木蝴蝶苷B、木蝴蝶苷A、白杨素-7-

O

-

β

-

D

-葡萄糖醛酸苷、黄芩素、白杨素可作为木蝴蝶的差异化合物；进一步采用网络药理学从有效性的角度对其进行分析，发现木蝴蝶苷A等4种活性成分能通过调控

AKT1

、

TP53

、

CASP3

、

MMP9

、

IL-4

等靶点作用于癌症通路、TNF信号通路、HIF-1信号通路、免疫信号等关键信号通路发挥抗炎，抗肿瘤，抗氧化作用。木蝴蝶苷A通过抑制AKT/GSK3

β

和STAT3信号通路的活性从而抑制肺腺癌细胞增殖；黄芩素可通过抑制AKT信号传导途径降低MMP-2和MMP-9的表达，从而抑制结肠癌细胞的侵袭和转移；白杨素-7-

O

-

β

-

D

-葡萄糖醛酸苷可通过干预HRAS、JUN、PTPRC调节PI3K-AKT、花生四烯酸代谢等信号通路发挥抗炎及免疫调节作用；白杨素能够通过促进心肌MMP-2的表达并激活MAPK信号通路改善急性心肌梗死大鼠的心脏恢复功能；木蝴蝶苷B通过调节MAPK信号通路、Ca离子信号通路和磷脂酶信号通路发挥体内抗肝癌活性。由此可见筛选得到的靶点和通路与木蝴蝶抗炎抗肿瘤的现代药理活性相契合，表明木蝴蝶Q-Marker的选取符合其药理药效特点。最后从化学成分可测性的角度对其主要成分进行定量分析，5种成分含量较高，可测性好，在不同产地木蝴蝶中差异显著，适合作为木蝴蝶的Q-Marker成分。综上所述，本研究初步预测木蝴蝶苷B、木蝴蝶苷A、白杨素-7-

O

-

β

-

D

-葡萄糖醛酸苷、黄芩素、白杨素为木蝴蝶潜在的Q-Marker，为后期深入研究木蝴蝶药效及作用机制提供参考，也有助于完善木蝴蝶的质量控制体系，提高质量控制水平。