雷公藤甲素二元醇质体的制备及评价

管咏梅，杨丽娜，胡育森，李哲，陈丽华，朱卫丰，吴文婷，臧振中（江西中医药大学，现代中药制剂教育部重点实验室，南昌 330004）

雷公藤甲素（triptolide，TP）是从传统中药雷公藤中提取出的环氧二萜内酯类化合物，具有显著的免疫调节、抗炎、抗生育及抗肿瘤等作用，但严重的毒副反应，尤其是肝肾毒性，限制了其临床应用。研究发现，TP经皮给药，既可减少消化道毒性，避免首过效应，又可透过皮肤缓慢、持续地发挥疗效。醇质体（ethosome）作为新一代脂质体，是由磷脂、高体积分数乙醇（或丙二醇等）和水组成的具囊泡结构的给药载体。与普通脂质体相比，其结构稳定、包封率较高、粒径较小，有更好的膜流动性，可使药物透过皮肤角质层或黏膜细胞，使其在皮肤真皮层上滞留量更多，是良好的皮肤与黏膜给药载体，在局部和全身治疗方面均具有较好的应用前景。二元醇质体（binary ethosome）是在醇质体的基础上进一步改进而得的，具有制备简单、性质更稳定、生物利用度更高及缓释药物等特点。同时，卵磷脂作为醇质体的必备成分，具有一定的抗氧化效果，也可在一定程度上减少皮肤毒性，增强患者的顺应性。因此，本试验拟将TP制备成二元醇质体，以增加其皮肤渗透量，缩短起效时间，提高TP的疗效，为TP经皮给药方式提供新的参考。

1 材料

1.1 仪器

Agilent 1260高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；TP-6智能透皮试验仪（天津正通科技有限公司）；Malwern Nano-S纳米粒度仪（英国马尔文公司）；超声波细胞粉碎仪（上海五相仪器有限公司，型号：JY92-IIDN）；SIGMA3-18K高速冷冻离心机（美国SIGMA公司）；透射电子显微镜（TEM）（FEI TeenaiTM Spirit TEM 120KV）；ZNCL-BS智能磁力搅拌器（西安安泰仪器科技有限公司）；BS124S 电子分析天平（北京Sartorius仪器系统有限公司）；EPED-ESL-10TH试验室级超纯水器（南京易普易达科技发展有限公司）；KQ3200E型超声波清洗器（昆明市超声仪器有限公司）。

1.2 试药

大豆卵磷脂（LipoidS100，德国Lipoid公司，批号：8030760）；胆固醇（北京索莱宝生物有限公司，批号：527G035）；TP对照品（质量分数≥98%，成都普菲德生物技术有限公司，批号：200724）；丙二醇、无水乙醇（分析纯，西陇科学股份有限公司）；甲醇（色谱级，美国Tedia公司）；超纯水（南京易普达科技发展有限公司）。

1.3 动物

SPF级健康雄性SD大鼠，体质量（200±20）g，购自江西中医药大学试验动物中心，许可证号SCXK（赣）2018-0003。

2 方法与结果

2.1 TP二元醇质体的制备[16]

称取适量大豆卵磷脂、胆固醇及丙二醇于烧杯中，加入TP乙醇水溶液，置磁力搅拌器（30℃，500 r·min）上混合均匀，作为醇相，吸取于注射器中；另取含一定量超纯水的烧杯置于磁力搅拌器中，将注射器中醇相缓慢滴加于水相，水合30 min，冰浴探头式超声（200 W，超声5 s，间隙5 s）5 min，混悬液用0.22 μm滤膜滤过，即得TP二元醇质体。空白二元醇质体同法制得。

2.2 TP含量测定

2.2.1 HPLC条件 色谱柱：Gemini-NX C110A（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流 动 相：甲 醇-水（50∶50，

V/V

），检测波长：218 nm，柱温：30℃，流速：1.0 mL·min，进样量：10 μL。

2.2.2 供试品溶液的制备 精密量取TP二元醇质体0.4 mL，甲醇破乳定容于5 mL量瓶中，超声10 min，0.22 μm滤膜滤过，即得TP二元醇质体供试品溶液。空白对照溶液除不加药物外同法可制得。

2.2.3 方法学考察

① 线性试验：精密称取TP对照品5.0 mg置10 mL量瓶中，甲醇定容，即得质量浓度为500 μg·mL的TP对照品储备液，用甲醇分别稀释为20、50、100、125、250、400 μg·mL的系列对照品溶液，HPLC分别测定峰面积，以TP质量浓度（

x

，μg·mL）对峰面积（

y

）作线性回归，得方程为：

y

＝19.13

x

－178.6，

r

＝0.9993，线性浓度范围为20～400 μg·mL。

② 专属性试验：将空白对照溶液、对照品溶液及TP二元醇质体供试品溶液，按照“2.2.1”项下条件检测，结果显示TP对照品溶液与TP二元醇质体供试品溶液出峰时间相同，且空白对照溶液在相应位置无干扰峰，表明专属性良好。

③ 精密度试验：分别取低、中、高3个质量浓度（20、100、250 μg·mL）的TP对照品溶液连续进样6次，结果得日内

RSD

分别为0.79%、0.66%、1.1%；连续测定3日，得日间

RSD

分别为0.85%、0.80%、0.88%，表明仪器精密性良好。④ 稳定性试验：供试品溶液于0、2、4、6、8、10、12、24 h进样检测，结果24 h内样品的

RSD

为0.69%，表明样品稳定性良好。⑤ 重复性和回收率试验：制备6份相同质量浓度（40 μg·mL）对照品溶液，进样检测，

RSD

为1.6%，表明重复性良好。取空白二元醇质体溶液1 mL共9份，加入同体积20、100、250 μg·mL的对照品溶液（

n

＝3），涡旋震荡，超声，进样测定，结果表明低、中、高质量浓度的TP加样回收率均在95%～105%，

RSD

分别为2.5%、1.9%、0.25%，符合要求。

2.3 包封率的测定

考察超滤离心法测定包封率的条件，向Nanosep 10 kDa 超滤管加入400 μL醇质体，分别以不同转速（4000、8000、12 000、16 000、20 000 r·min）和时间（5、10、15、20、25 min）离心，取续滤液，甲醇定容至5 mL量瓶，进样检测。结果离心转速为16 000 r·min、离心时间为15 min，组内样品浓度

RSD

均小于5%，重现性高。设超滤离心后定容的溶液中TP浓度为

C

，取等量（400 μL）TP二元醇质体加甲醇破乳定容至5 mL，测得TP浓度为

C

，包封率EE（%）＝（1－

C

/

C

）×100%，其中

C

表示游离药物的量；

C

为TP二元醇质体悬液中药物的总量。

2.4 单因素考察

参考相关文献，可知制备温度、磁力搅拌器转速、水合时间、超声功率、胆卵比（胆固醇∶卵磷脂）、二元醇比例、TP投药量、卵磷脂、醇相用量等9个因素对二元醇质体的制备工艺有较大影响，因此需考察各因素对包封率和粒径的影响，明确制备工艺参数。

考察不同制备温度（25、35、45、55、65℃）、不同转速（300、400、500、600、700 r·min）、不同水合时间（10、20、30、40、50 min）、不同超声功率（100、150、200、250、300 W）、胆卵比（1∶10、2∶10、3∶10、4∶10、5∶10）、二元醇（乙醇∶丙二醇）比例（9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5）、TP投药量（2、4、6、8、10 mg）、卵磷脂用量（0.25%、0.50%、1.0%、1.50%、2.0%、2.50%、3.0%）、醇相用量（20%、30%、40%、50%、60%）的影响，从粒径和包封率的变化趋势可确定TP二元醇质体的制备温度为35℃、转速为600 r·min、水合时间为30 min、超声功率为300 W、二元醇比例为7∶3、胆卵比为1∶5；而在试验中发现投药量、卵磷脂用量及醇相用量三个因素对制剂稳定性影响较大，因此需进一步优化工艺参数（见图1）。

图1 单因素试验考察各因素对二元醇质体制备工艺的影响Fig 1 Effect of various factors on the preparation of binary ethosomes by single factor test

2.5 Box-Behnken响应面法优化处方

根据单因素试验结果，选择投药量、卵磷脂用量及醇相用量作为研究因素，运用Design Expert 8.0.6软件优化处方，以粒径和包封率为评价指标，因素水平表和试验组设计分别见表1和表2。

表1 因素水平表Tab 1 Factor and level

水平 因素A.投药量/mgB.卵磷脂用量/（mg·mL－1）C.醇相用量/%－1 6 2 30 0 8 6 40 1 10 10 50

表2 Box-Behnken试验设计表
Tab 2 Box-Behnken experimental design table

No. A. 投药量/mg B. 卵磷脂用量/（mg·mL－1）C. 醇相用量/% 粒径/nm 包封率/%1 8.00 6.00 40.00 127.80 61.47 2 8.00 10.00 50.00 222.80 64.60 3 6.00 6.00 50.00 227.80 62.98 4 8.00 6.00 40.00 132.10 75.34 5 8.00 2.00 50.00 214.30 70.17 6 8.00 6.00 40.00 123.80 72.14 7 8.00 10.00 30.00 151.20 55.62 8 10.00 6.00 30.00 161.60 59.81 9 6.00 10.00 40.00 118.40 52.96 10 8.00 6.00 40.00 128.20 66.24 11 8.00 6.00 40.00 133.20 66.78 12 10.00 6.00 50.00 235.80 70.61 13 6.00 2.00 40.00 126.30 36.95 14 10.00 10.00 40.00 126.50 60.54 15 10.00 2.00 40.00 130.10 53.88 16 6.00 6.00 30.00 145.40 58.32 17 8.00 2.00 30.00 127.80 37.49

2.5.1 粒径模型方程拟合 通过各项结果得回归方程为：

Y

＝129.02＋4.51

A

＋2.55

B

＋39.34

C

＋1.08

AB

－2.05

AC

－3.72

BC

＋4.97

A

－8.66

B

＋58.67

C

。可知在该条件下，对TP二元醇质体粒径影响因素由大到小为C＞A＞B，即醇相用量＞投药量＞卵磷脂用量，且各因素存在交互作用，方程

R

＝0.9888，失拟项为0.0577，表明相对于纯误差没有显著性差异，证明回归方程拟合成功。显著性检验结果显示

C

＜0.0001，为极其显著。采用二次多项回归方程对试验数据拟合，以粒径为中心，绘制等高线和三维曲面图，预测TP二元醇质体的最佳处方，结果见图2。

图2 粒径的效应值与各因素的三维曲面图和等高线图Fig 2 Three-dimensional surface plot and contour plot of the effect value of particle size and factors

2.5.2 包封率模型方程拟合 通过各项结果得回归方程为：

Y

＝68.39＋4.20

A

＋4.40

B

＋7.14

C

－2.34

AB

＋1.54

AC

－5.92

BC

－5.68

A

－11.64

B

＋0.21

C

。可知在该条件下，对TP二元醇质体包封率影响因素由大到小为C＞B＞A，即醇相用量＞卵磷脂用量＞投药量，且各因素存在交互作用，方程

R

＝0.8680，失拟项为0.3527，表明相对于纯误差没有显著性差异，证明回归方程拟合成功。显著性检验结果显示

B

＜0.005，较为显著。采用二次多项回归方程对试验数据拟合，以包封率为中心，绘制等高线和三维曲面图，预测TP二元醇质体的最佳处方，结果见图3。

图3 包封率的效应值与各因素的三维曲面图和等高线图Fig 3 Three-dimensional surface plot and contour plot of the effect value of the encapsulation rate and factors

2.5.3 最优处方及验证试验 由响应面优化的结果可知，最终确定处方方案：TP投药量为8.3 mg，卵磷脂浓度为6.9 mg·mL，醇相用量为38.5%。进行3次平行试验，粒径的预测值为125.634 nm，实际值为（124.7±0.46）nm，

RSD

为0.37%，包封率的预测值为68.3377 nm，实际值为（67.26±1.33）nm，

RSD

为2.0%，表明预测值与实际值无显著性差异，建立的模型预测性良好。

2.6 TP二元醇质体质量评价

2.6.1 外观评价 制备最优处方的醇质体，观察其外观澄清透明，有淡蓝色乳光。

2.6.2 粒径、PDI与电位分布 按最优处方平行制备TP二元醇质体3份，使用27%乙醇生理盐水稀释10倍，测定最优处方的二元醇质体（

n

＝3）平均粒径为（124.7±0.46）nm，PDI为（0.166±0.02），Zeta电位为（－14.7±0.47）mV，如图4。

图4 二元醇质体粒径与Zeta电位分布Fig 4 Particle size and Zeta potential distribution of binary ethosomes A.粒径（particle size）；B.电位（Zeta potential）

2.6.3 形态观察 吸取TP二元醇质体20 μL滴加于铜网上，5%磷钨酸负染，干燥后置于透射电镜下观察TP二元醇质体为类球囊状，如图5。

图5 二元醇质体透射电镜图（×40 000）Fig 5 Transmission electron microscopy of the binary ethosomes（×40 000）

2.6.4 稳定性考察 将3份TP二元醇质体分别放置于4℃冰箱及25℃恒温箱中保存7 d，测定包封率、粒径和PDI，结果见表3，可知4℃各项指标均优于25℃，可能是4℃下乙醇挥发减少，卵磷脂稳定性较好，因此选择在低温条件4℃下进行保存。

表3 二元醇质体稳定性试验(＝3)
Tab 3 Stability test of binary ethosomes (＝3)

时间/d 粒径/nm PDI 包封率/%4℃ 25℃ 4℃ 25℃ 4℃ 25℃0 125.3±0.46 125.3±0.46 0.173±0.004 0.173±0.004 68.28±1.33 66.35±1.45 3 126.2±1.28 127.93±1.10 0.195±0.018 0.198±0.012 66.74±1.63 66.74±1.63 7 130.6±2.11 149.26.6±5.61 0.226±0.014 0.278±0.010 63.31±2.29 53.11±2.74

2.7 体外透皮研究

2.7.1 供试液的制备 按照“2.1”项下制备TP二元醇质体溶液；将丙二醇换为乙醇同“2.1”项下方法制得TP普通醇质体和TP乙醇水溶液。

2.7.2 Franz扩散池体外透皮试验 大鼠麻醉后除去腹部粗毛和绒毛，剪下腹部皮肤后颈椎脱臼处死，去除腹部皮肤下多余的脂肪和组织用生理盐水并清洗干净，滤纸擦干。取30%乙醇生理盐水15 mL为接收液，大鼠皮平铺在改良的Franz扩散池上，角质层朝上，真皮层朝下，排出装置内气泡，封口后置于池中[水浴（37±0.2）℃，300 r·min]，活化皮肤30 min以上，TP乙醇水溶液、TP普通醇质体、TP二元醇质体溶液分别给药1 mL，于2、4、6、8、10、12、24 h取 样1 mL，同时补充等量的37℃接收液，测定样品含量。

2.7.3 标准曲线的建立 精密量取质量浓度为500 μg·mL的TP对照品储备液1.6 mL置10 mL量瓶中，用30%乙醇生理盐水定容，即得80 μg·mL的TP稀释对照品溶液，逐级对半稀释，得到40、20、10、5、2.5、1.25 μg·mL的对照品溶液，0.22 μm滤膜滤过，进样测定峰面积，以TP质量浓度（

x

，μg·mL）对峰面积（

y

）作线性回归得方程为：

y

＝19.45

x

＋2.198，

r

＝0.9999，线性范围为1.25～80 μg·mL。2.7.4 方法学考察 方法同“2.2.3”项下，结果日内，日间精密度

RSD

均小于0.76%，24 h样品稳定性

RSD

为0.35%，重复性

RSD

为1.1%，均符合要求。取某给药组24 h接收液0.5 mL共9份，加入同体积2.5、10、40 μg·mL的对照品溶液（

n

＝3），涡旋震荡，超声，按照“2.2.1”项下条件检测，结果表明回收率均在95%～105%，

RSD

分别为3.8%、4.1%、1.4%，符合要求。

取最低质量浓度1.25 μg·mL的对照品溶液，按照“2.2.1”项下条件检测，信噪比大于10，定量限检验符合要求。

2.7.5 单位面积累积透过量 利用体外透皮试验中TP普通醇质体、TP二元醇质体和TP乙醇水溶液的累积透过量与时间的关系进行释放特性研究，根据拟合方程结果及渗透动力学参数表示TP二元醇质体的体外透皮效果。公式如下：

上式中

Q

为第

n

各时间点的单位面积累积透过量，

A

表示有效透皮面积，

C

为第

n

个点测得的药物浓度，

V

为接收池体积，

V

为每次取样体积。计算TP普通醇质体、TP二元醇质体和TP乙醇水溶液各个时间点的单位面积累积透过量，绘制透过量（

Q

，μg·cm）-时间（

t

，h）曲线，结果见图6，表明TP普通醇质体、TP二元醇质体和TP乙醇水溶液中TP 在24 h单位面积累积透过量分别为（549.99±47.97）、（751.62±27.38）、（957.71±40.20）μg·cm。将数据进行零级动力学方程、一级动力学方程和Higuchi 方程模型拟合，结果见表4，根据

R

可知，TP二元醇质体符合Higuchi方程，对

Q

（μg·cm）-

t

（h）进行线性回归分析，得直线斜率即为稳态透皮速率（

J

），渗透动力学参数以拟合度最高的方程为准，见表5。

图6 普通醇质体、二元醇质体和TP乙醇水溶液的Qn（n＝3）Fig 6 Qn of ethosomes，binary ethosomes and ethanol-water solution of triptolide（n＝3）

表4 TP普通醇质体、TP二元醇质体和TP乙醇水溶液的体外透皮量-时间模型拟合
Tab 4 Model fitting equation of in vitro transdermal volume-time of ethosomes，binary ethosomes and ethanol-water solution of triptolide

制剂 模型 拟合结果 拟合优度（R2）TP普通醇质体零级动力学模型Q＝25.406t－13.209 0.9363一级动力学模型lgQ＝0.0598t＋1.5894 0.6935 Higuchi模型 Q＝166.55t1/2－254.70 0.9635 TP二元醇质体零级动力学模型Q＝33.964t＋18.784 0.9038一级动力学模型lgQ＝0.0535t＋1.8577 0.6719 Higuchi模型 Q＝255.79t1/2－313.12 0.9565 TP乙醇水溶液零级动力学模型Q＝43.162t＋33.698 0.8934一级动力学模型lgQ＝0.053t＋1.9791 0.6613 Higuchi模型 Q＝288.11t1/2－391.47 0.9531

表5 TP普通醇质体、TP二元醇质体和TP乙醇水溶液的渗透动力学参数
Tab 5 Osmotic kinetic parameters of ethosomes，binary ethosomes and ethanol-water solution of triptolide

制剂 Q-t方程 R2 Q24/（μg·cm－2） Js/（μg·cm－2·h）TP普通醇质体 Q＝166.55t1/2－254.70 0.9635 549.99±47.97 166.55 TP二元醇质体 Q＝255.79t1/2－313.12 0.9565 751.62±27.38 255.79 TP乙醇水溶液 Q＝288.11t1/2－391.47 0.9531 957.71±40.20 288.11

体外透皮给药研究发现，TP二元醇质体的释药速率和累积释放量要明显高于普通醇质体，且相较于TP乙醇水溶液，TP二元醇质体的TP释放与Higuchi模型拟合度较高，表明TP二元醇质体具有较好的皮肤穿透力。

3 讨论

近年来，外用制剂的开发为有毒中药的临床应用带来更广阔的前景，尤其是在提高药物渗透、安全无毒等理念的研究环境下，柔性脂质体一出现就备受关注。二元醇质体在其制备方式上打破了传统醇质体的束缚，提示更多元化醇质体开发的可能性。

TP作为雷公藤的主要活性成分，能对关节炎等疾病起到良好的治疗作用，且经皮给药制剂是关节炎治疗中常用的给药方式，具有能直接作用于病灶部位、起效速度快及毒副作用小等优点，故本研究将TP制成二元醇质体并对其进行质量评价。参考醇质体制备工艺，以粒径和包封率作为重要的评价指标，选取对二元醇质体影响较大的投药量、卵磷脂用量、醇相用量三个因素进行Box-Behnken设计，优化处方，最终确定TP二元醇质体制备工艺为制备温度35℃、转速600 r·min、水合时间30 min、超声功率300 W、二元醇比为7∶3、 胆卵比为1∶5，TP投药量8.3 mg，卵磷脂浓度6.9 mg·mL，醇相用量38.5%，并加以验证。经过外观、粒径、PDI与电位、形态、稳定性的检测，证明制得的TP二元醇质体分布均匀，稳定性较好，且释药速率和累积释放量均高于普通醇质体，相较于TP乙醇水溶液，与Higuchi模型拟合度较高，具有较好的皮肤穿透力，可为TP经皮给药剂型提供参考。接下来课题组会将其制备成凝胶剂，并对其进行评价，旨在为TP临床应用提供一种更为安全、有效的药物制剂。