皂荚提取物对肝细胞癌大鼠TGF-β/Smads信号通路调控和微血管密度的影响*

2022-03-29王晓东张赤志

中西医结合肝病杂志 2022年3期

关键词：皂荚提取物通路

肝细胞癌(HCC)是恶性程度较高的肿瘤

。目前现代医学治疗肝癌的方法主要有手术、放疗、化疗、分子靶向治疗、介入治疗、动脉化学栓塞和干扰素、白细胞介素-Ⅱ、淋巴因子激活的杀伤细胞等免疫疗法

，但成本昂贵，毒副作用较大。中医药对HCC的治疗是多角度，多层次的，能抑制肿瘤细胞生长、提高患者免疫功能、减少并发症和毒副作用，具有明显的治疗效果

。

皂荚又名皂角，具有祛除顽痰, 通窍开闭, 祛风杀虫等作用。近年来，关于中药皂荚在HCC治疗中的应用进行了很多研究

。研究发现TGF-β/Smads信号传导通路的异常可导致肝细胞生长周期紊乱，促进细胞持续分裂增殖，导致HCC发生

。本实验观察皂荚提取物(乙酸乙酯提取物)对TGF-β/Smads信号通路中Smad4和Smad7两个重要蛋白表达的影响，为皂荚提取物防治HCC提供理论和实验依据。

无奈退到客厅，看见车钥匙在桌上，那女的已经说了，我不会开车的。保安说，那怎么办？那女的两手一摊，我也没办法，我又推不动那车。冯一余只得自认倒霉，说，你把车钥匙给我，我替你开走。那女的还有些不放心，你行吗？别把我们的车蹭坏了。

在农村水电改革发展实践中，深刻体会到农村水能资源是广大贫困山区赖以生存发展的宝贵资源，农村水电开发必须考虑当地群众的关切，更多惠及当地农民；必须在规划、建设和运行过程中更加重视保护生态环境，不能以牺牲环境为代价；必须加强法规制度建设，做到依法行政；必须加快改革步伐，健全市场机制，充分发挥市场作用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

基于设计的大豆根系L系统，在VC++6.0开发平台下，借助OpenGL强大的三维图形和模型库进行构建，系统充分考虑根系间夹角、侧根弯曲度和根系生长量的变化，并采用随机函数实现各量值的随机变化，从而使生成的图形具有更好的视觉效果，随机生成的大豆根系拓扑模型如图2所示。

1.1.2 大鼠肝癌细胞来源 H22细胞的荷瘤昆明种大鼠1只(体重37.5 g，收集腹水时)。

1.1.1实验动物昆明种大鼠60只，体重为(20±2)g，雄性，清洁级购于湖北省动物实验研究中心[合格证号：SCXK(鄂)2020-0005]。本课题实验动物伦理通过了湖北省中医院动物伦理申请委员会的批准，其编号为：JN.No20190615S0640120[358]。

2.2 6组大鼠MVD表达情况见表2。

1.1.4 主要试剂 dNTP、TaqDNA聚合酶、cDNA、上下游引物、ddH等主要试剂均购自上海生工生物工程技术服务有限公司；ReverTra Ace-α-逆转录试剂盒、SYBR Green realtime PCR master mix(TOYOBO公司)；去离子水、TRIzo1 Reagent、三氯甲烷、异丙醇、无水乙醇(购于医院药房)；Rea1-time PCR Detection System(SLAN，HONGSHI)。

1.2 实验方法

我四岁时，爸妈离婚了。爸爸回了老家，再也没有出现过，也没给过一分钱抚养费。尽管如此，妈妈在我面前，却从不说爸爸任何不是。她总是开朗的、健康的、无坚不摧的，什么问题她都能解决的样子。

2.1 5组大鼠肝脏组织smad4 mRNA、Smad7 mRNA表达情况见表1。

1.2.2 实验方法将60只大鼠随机分为6组：模型组、皂荚提取物高、中、低剂量组(简称高、中、低剂量组)、阳性对照组、空白对照组，每组10支。除空白对照组外，其余5组大鼠均在右腋窝皮下接种H22肝癌细胞悬液0.2 ml造模。造模第2天开始分别给各组大鼠灌胃相应药物：高剂量组大鼠灌胃皂荚提取物26 mg/d(体积0.4 ml)，中剂量组大鼠灌胃皂荚提取物13 mg/d(体积0.4 ml)，低剂量组大鼠灌胃皂荚提取物7.8 mg/d(体积0.4 ml)，阳性对照组大鼠灌胃索拉菲尼7.8 mg/d(体积0.4 ml)，模型组和空白对照组大鼠灌胃等体积的生理盐水。1次/d，共30 d。造模后第32天处死大鼠，采集标本进行各指标检测。

1.2.4 微血管密度(MVD)的判断标准参照Weidner校正方法，任何被抗体染色的单个内皮细胞或细胞团，不管是否形成管腔，只要与周围的微血管、肿瘤细胞和其他连接组织有清楚界限，都认为是一个可计数的微血管。先用低倍镜(×10)在每一个标本下选取热点(5个微血管数最多的区域)，然后在每一个热点中计算一个高倍镜(×40)下的微血管数目，取其平均值为MVD值。

1.2.3 smad4 mRNA、Smad7 mRNA检测取出肝脏组织,以4%甲醛溶液固定, 修剪组织并冲洗后经梯度酒精脱水，石蜡包埋切片(片厚6 μm)、以鼠抗-CD34(1∶50)为第一抗体，EnVision(rat)为第二抗体(均购于Abcam公司，货号：Ab185732)进行免疫组织化学染色。采用Image Pro Plus v6.0 图像分析软件进行分析。

肝癌的产生、侵袭、转移与体内肿瘤新生血管的形成、多种基因的突变、细胞信号传导通路密切相关

。目前已知与肝癌细胞生长和转移复发相关的分子通路主要有4条

，其中TGF-β/ Smads信号传导通路起着非常重要作用。

2 结果

1.2.1 肝癌细胞制备将荷瘤昆明种大鼠颈椎脱臼处死，收集含有H22肝癌细胞荷瘤大鼠的腹水15 ml, 在湖北省中医院实验室中使用BFX5-320低速离心分离机提取H22肝癌细胞, 然后加入无菌注射用水调整细胞悬液中肿瘤细胞浓度至4×10

/L。

1.1.3 索拉菲尼为北京建生药业有限公司产品，购自医院药房。

3 讨论

即使是白内障医师操作娴熟，手术成功，也依然有较多的患者存在持续3个月的眼表不适，特别是原本存在干眼或眼表疾病的患者。很多研究者认为这是由多因素造成的干眼症的进展和恶化[19-21]，这些因素包括术前结膜囊消毒液聚维酮碘的化学刺激、术中角膜切口对角膜神经的破坏、显微镜的光毒性、术中和术后局部眼科用药及滴眼液中防腐剂苯扎氯铵的化学性刺激，术后炎症因子的释放等。

TGF-β细胞生长、分化可参与调节肿瘤的发生和进展。TGF-β/Smads信号传导通路是由TGF-β受体、Smads蛋白质家族及其细胞核转导调节剂构成的。Smad4和Smad 7作为TGF-β/ Smads信号转导途径中的重要分子，在TGF-β受体激活信号转导过程中发生基因改变时,阻断TGF-β信息继续向细胞内传递,使细胞增殖失去控制,从而发生肝细胞癌变

。

五四时期，除了本土的封建主义意识形态，附着于各种思潮的西方意识形态也涌入中国，如功利主义（实用主义）、无政府主义、基尔特社会主义、新村主义，等等，宣扬着各自对社会的见解和主张。在各种主义中，有的标榜赞成“共产主义”或“社会主义”，但其内容和实质却是伪社会主义或反马克思主义的，一时让人难辨真假，阻碍着马克思主义的科学社会主义的传播。马克思主义与一些反马克思主义的意识形态进行了较长时间的论战，比较著名的是与功利主义（实用主义）、基尔特社会主义、无政府主义的论争。

在Smads信号传导过程中，Smad4基因被确认为肿瘤抑制基因，Smad4与各种不同的Smads蛋白协同作用，共同发挥抗癌作用。其水平降低，就会使抑制肝癌的效应降低。张宇恒

的研究结果提示，Smad4低表达与肝癌的发生发展及恶性程度密切相关，可能在肝癌的启动、促进、发展或转移等各个阶段起着重要作用。而Smad7表达增强，则有助于肿瘤的发生，且能促进细胞向恶性化进展

。

以索拉菲尼为代表的多靶点激酶抑制剂具有较好的有效性和安全性，可作用于多个靶点，对多种肿瘤细胞有抑制作用，它能延长HCC患者生存期,是晚期肝癌患者重要治疗药物

。索拉菲尼不但可以直接阻断肿瘤细胞的增殖,还可以抑制血管的新生，故本研究将其作为阳性对照药物。

肝癌的产生、侵袭、转移与体内肿瘤新生血管的形成密切相关，许多学者把MVD作为肿瘤新生血管形成的重要标志来反映肝癌的生物学行为

。因此本实验以MVD的变化来探测皂荚提取物对HCC的防治情况。

近年来，皂荚治疗HCC取得一定成果，2005 年美国国立癌症研究所和香港理工大学研究发现, 皂荚浓缩液具有抗癌特性，可抑制乳腺癌、肝癌等实体癌细胞生长

。张振宇等

发现皂荚提取物对人肝癌细胞bel-7402的增殖具有显著抑制作用，能够诱导细胞凋亡，阻止肿瘤细胞无限增殖；研究表明，细胞增殖周期的调控与端粒酶活化密切相关，端粒酶活化有可能是所有恶性肿瘤发生的一个必经之路

。还有实验发现，皂荚提取物可以抑制肝癌be-l 7402细胞端粒酶活性,使抑癌基因活化、促癌基因失活，促进癌细胞凋亡

。汪红卫等

研究结果证实猪牙皂正丁醇提取物含药血清，能抑制人肝癌细胞SMMC-7721。

本研究结果表明,皂荚提取物可明显提高带瘤大鼠肝组织中Smad4基因表达、降低Smad7基因表达，从而加强TGF-β/ Smads信号传导通路，起到抗癌作用。究其机制：①皂荚提取物能增加肿瘤抑制基因的活化和促癌基因的失活起到抗癌作用。②皂荚提取物能够抑制肿瘤细胞的端粒酶活性，加快肿瘤细胞凋亡。③皂荚提取物能够减少肿瘤新生血管的生成，减少肿瘤血供抑制肿瘤生长。因此，皂荚提取物可成为治疗HCC的有效药物。

利益冲突声明：本研究不存在研究者、伦理委员会成员、受试者监护人以及与公开研究成果有关的利益冲突，特此声明。

[1] 胡品津，刘新光.消化内科学[M].北京：人民卫生出版社，2008：188.

[2] 温宗秋,刘魁凤.原发性肝癌的治疗分析[J].中国肿瘤临床康复，2000,12(3):47-49.

[3] 中国抗癌协会肝癌专业委员会,中国抗癌协会临床肿瘤学协作专业委员会,中华医学会肝病学分会肝癌学组.原发性肝癌规范化诊治的专家共识[J].临床肝胆病杂志,2009,25(2):91.

[4] 杜进军 ,罗漪 .化痰药皂荚治疗肝癌[J]. 吉林中医药,2010,30(3)：256-257.

[5] 王宏伟.皂荚提取物抗肝癌有效部位筛选及研究[D].湖北中医药大学,2010.

[6] 张振宇,张晓丽,程红球.皂荚抗肝癌细胞成分的初步研究[J].中国中医急症,2012,21(8):1266-1268.

[7] SHI Y. Structural in sights on Smad function in TGF beta signaLi-ng[J]. Bioessays, 2001,23(3):223-232.

[8] 代智,周俭,樊嘉. 肝细胞癌发生和发展相关的重要分子通路[J].中华肝脏病杂志，2010,18(12):955-957.

[9] 富翠芹、王沁、尹蓉，等.PI3K/AKT 信号转导通路在肝癌细胞生长和黏附中的作用[J].世界华人消化杂志,2008,16(14):1493-1498.

[10] Villanueva A，Toffanin S，Llovet JM.Linking molecular classification of hepatocellular carcinoma and personalized medicine：preliminaly steps[J]. Curr Opin Oncoi,2008,20:444-453.

[11] 彭望君,陆定波.中药皂荚提取物对肝癌细胞TGF-β1mRNA信号表达的影响[J].湖北中医杂志,2010,32(5):6-7.

[12] 张振宇,张赤志,许汉林, 等.皂荚提取物对人肝癌细胞相关癌基因表达的调控作用及端粒酶的影响[J].中西医结合肝病杂志,2008,18(2):93-95.

[13] 彭望君.皂荚提取物对大鼠肝癌细胞TGF-β1信号传导通路的影响[D].湖北中医药大学,2010.

[14] 张宇恒,张连峰. 原发性肝细胞癌组织Smad4、p21蛋白的表达及其临床意义[J].山东医药，2008，48(31)：9.

[15] Im YH, Lee HS, Lee HJ，

. Prognostic significance of the expression of Smad4 and Smad7 in human gastric carcinomas[J]. Annals of Oncology, 2004,15:574-580.

[16] Kozma SC, Thomas G.Regulation of cell size in growth,development and human disease:PI3K,PKBand S6K[J].Bioassays,2002,24:65-71.

[17] Kaku T, Kamura T, Kinukawa N,

. Angiogenesis in endometrial carcinoma[J].Cancer,1997,80(4):741-747.

[18] 香港理工大学.中药皂荚浓缩液具有抗癌特性[J].山东中医药大学学报,2005,31(4):286.

[19] 张振宇，张晓丽，程红球. 皂荚抗肝癌细胞成分的初步研究[J].中国中医急症,2012,21(8):1266-1268.

[20] Kin NW，Piatysezk MA，Prouse KR，