液相色谱-串联质谱测定速冻肉制品中的喹诺酮类药物

董贵军，乔勇升，胡慧，陈伟，冯寅洁，王萍

泰州市食品检验院（泰州 225300）

喹诺酮类抗生素（Quinolones，QNs）又称吡酮酸类或吡啶酮酸类抗生素，是一类具有抗菌谱广、抗菌性强、价格低廉等特点的人工合成抗菌药，其被广泛用于人和动物疾病的预防和治疗中[1-2]。

近年来，随着该类药物的过量使用，其在动物体内残留并通过食物链进入人体，危害人体健康。联合国粮农组织、欧盟、美国、日本等均制定喹诺酮类药物动物组织中的最高残留限量（MRLs）[3-4]。我国农村农业部对动物源性食品中多种喹诺酮类药物制定了最高残留限量[5]。因此，对动物源食品中QNs残留量的检测尤为重要。

目前，QNs的检测方法主要有酶联免疫分析法、高效液相色谱法、高效液相色相串联质谱法等。由于液相色谱串联质谱法具有特异性强、灵敏度高等优点[6-12]，已成为动物源性食品中药物残留分析的首选方法。当前现行检测动物源性食品中喹诺酮类抗生素的国家标准方法为高效液相色谱-串联质谱法，GB/T 20366—2006[13]和GB/T 21312—2007[14]均采用外标法定量，但前处理过程均耗时长，操作繁琐。

此次试验采用对脂类物质有较好净化作用的Oasis PRiME HLB固相萃取小柱，采用通过式净化方式去除样品中干扰物，获得理想的净化效果，使样品前处理过程更加简便省时，适合大批量日常分析检测。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

恩诺沙星（Enrofloxacin，CAS：93106-60-6）、环丙沙星（Ciprofloxacin，CAS：97867-33-9）、诺氟沙星（Norfloxacin，CAS：70458-96-7）、氧氟沙星（Ofloxacin，CAS：82419-36-1）、沙拉沙星（Sarafloxacin，CAS：98105-99-8）、司帕沙星（Sparfloxacin，CAS：110871-86-8）、氟罗沙星（Fleroxacin，CAS：79660-72-3）、依诺沙星（Enoxacin，CAS：84294-96-2）、奥比沙星（Orbifloxacin，CAS：113617-63-3）、洛美沙星（Lomefloxacin，CAS：98079-52-8）、甲磺酸培氟沙星（Pefioxacin mesylate，CAS：70458-95-6）、萘啶酮酸（Nalidixic acid，CAS：389-08-2）、噁喹酸（Oxolinic acid，CAS：14698-29-4）、氟甲喹（Flumequine，CAS：42835-25-6）、达氟沙星（Danofloxacin，CAS：112398-08-0）、盐酸二氟沙星（Difloxacin hydrochloride，91296-86-5），浓度≥98.0%，德国Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；甲醇、乙腈均为色谱纯（西班牙Scharlau公司）；乙酸、乙酸铵均为LC-MS级试剂（美国Anaqua公司）；无水硫酸钠为分析纯（国药集团化学试剂有限公司）；Oasis PRiME HLB固相萃取柱（6 mL，200 mg，美国Waters公司）；尼龙66针式滤膜（0.22 μm，天津津腾公司）；氮气、氩气（＞99.999%）。试验用水由Milli-Q超纯水机制备。试验中所检测的样品（羊肉卷、肥牛卷）均为市售。

1.2 仪器与设备

ACQUITY UPLC H-Class超高效液相色谱仪，Waters Xevo TQ-S三重四极杆质谱仪、MassLynx V4.1数据处理操作平台（美国Waters公司）；Allegra 64R台式冷冻高速离心机（美国Beckman Coulter公司）；Milli-Q Reference超纯水机（美国Millipore公司）；XS204型电子分析天平（感量为 0.000 01 g，瑞士Mettler Toledo公司）；JP-100超声波清洗器（深圳市洁盟清洗设备有限公司）。

1.3 标准溶液的制备

16种喹诺酮类药物混合标准溶液于-18 ℃冷冻保存。使用时放置室温，移取适量的混合标准溶液用“1.6”空白基质提取液稀释，配制质量浓度分别为0.1，0.5，1.0，5.0，10.0，50.0和100.0 μg/L的混合标准工作液，置于棕色瓶中，于4 ℃冰箱中保存备用。

1.4 质谱条件

电离模式：ESI（+）；毛细管电压3.0 kV；RF透镜电压0.5 V；源温120 ℃；脱溶剂温度350 ℃；脱溶剂气流速650 L/h；锥孔气流速50 L/h；采集模式：MRM采集，其他参数见表1。

表1 16种喹诺酮类药物的质谱检测参数

1.5 色谱条件

色谱柱：Waters Acquity UPLC HSS T3柱（1.8 μm，2.1 mm×100 mm）；流动相A：乙腈；流动相B：0.1%甲酸溶液；流速0.5 mL/min；柱温35 ℃；进样量10 μL；梯度洗脱程序：0→0.4 min，维持12% A；0.4 min→1.0 min，12% A→16% A；1.0 min→2.4 min，16% A→30% A；2.4 min→3.0 min，30% A→70% A；3.0 min→3.6 min，70% A→80% A；3.6 min→3.7 min，80% A→12% A；流量0.50 mL/min。

1.6 样品前处理

样品放置室温解冻后均质处理，称取2 g（精确至0.01 g）均匀样品于50 mL离心管中，加入20 mL含0.2%甲酸的乙腈，漩涡混合30 s，超声提取5 min，在5 000 r/min下离心5 min。取2 mL上清液通过PRiME HLB小柱，用5 mL乙腈洗净小柱残留，吹干柱床收集全部滤液。滤液经氮气吹干后加2 mL含0.1%甲酸的乙腈/水（50∶50，V/V）溶解残渣，过0.22 μm有机相滤膜，待测。

空白基质提取液的配制，根据配制曲线的使用量，称取适量空白基质样品，按上述步骤处理，得到的空白基质提取液用于配制标准工作曲线。

2 结果与分析

2.1 质谱条件优化

喹诺酮类化合物分子结构中含有羰基等多电子基团，易于在ESI源的正离子模式下形成[M+H]+准分子离子。采用直接进样方式，在ESI正离子模式下分析1.0 μg/mL的16种喹诺酮类药物的混标溶液，通过优化毛细管电压、锥孔电压、碰撞能量等仪器参数，确定化合物母离子，并选取响应强度较高、干扰较小的两个子离子作为定性离子和定量离子，建立多离子反应监测（MRM）方法，同时确定子离子的最佳碰撞电压。16种喹诺酮类药物的母离子、子离子、锥孔电压、碰撞能量等质谱参数见表1。

2.2 色谱条件优化

不同色谱柱对多种喹诺酮类药物的分离效果存在一定差异，试验考察了不同色谱柱测定喹诺酮类药物时的分离效果。分别选用Waters Cortects C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，2.6 μm）、Waters Acquity UPLC HSS T3色谱柱（2.1 mm ×100 mm，1.8 μm）、Waters BEH C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）考察分离效果。结果表明：Waters Cortects C18色谱柱在多组分分离过程中易造成多个物质同时出峰而灵敏度下降的情况；Waters BEH C18色谱柱造成部分化合物拖尾现象；Waters Acquity UPLC HSS T3色谱柱在MRM模式下可以对多组分实现较好的分离，且各色谱峰峰形较好，目标物相互干扰小。故试验选用Waters Acquity UPLC HSS T3色谱柱。

在提高检测的灵敏度上，采用在流动相的水相中添加0.1%（V/V）的甲酸，以增强ESI+模式下待测物的离子化效率。有研究表明，流动相中加入一定的有机酸可显著提高两极性QNs的分离度和离子化效率，而对于C-7环上缺少哌嗪环的酸性QNs的影响不大[15]。

2.3 前处理条件的选择

速冻肉制品中存在大量的脂肪类物质，极大干扰目标化合物的分析。试验采用酸性乙腈水溶液提取样品中的喹诺酮类抗生素，并使用对脂肪蛋白质有吸附作用的PRiME HLB固相萃取小柱进行净化。结果发现，16种喹诺酮类抗生素在此固相萃取小柱上不被吸附，可以使用通过式策略进行净化。

2.4 基质效应的测定

基质效应由分析物的共流出组分影响电喷雾接口的离子化效率所致，表现为离子增强或抑制作用[16]。试验分别用初始流动相和空白基质溶液配制标准曲线，考察基质效应的影响。结果表明，当采用流动相直接配制标准曲线时，16种喹诺酮类药物普遍存在程度不一的基质抑制效应，因此在实际检测中采用空白基质溶液配制曲线可有效减轻基质干扰，使定量分析更加准确。

2.5 线性关系、检出限和定量限

在该方法确定的最优色谱和质谱条件下，以“1.6”所制空白基质提取液配制系列质量浓度的混合标准工作溶液，并进行UPLC-MS/MS分析。以质量浓度X（μg/L）为横坐标、定量离子峰面积Y为纵坐标绘制标准曲线，得到回归方程与相关系数（r2），结果见表2。通过向空白阴性样品中添加目标物来考察方法的检出限（SLOD，S/N=3）、定量限（SLOQ，S/N=10），结果见表2。

表2 16种喹诺酮的线性方程、线性范围、相关系数、检出限及定量限

由表2可知，该方法检测的16种喹诺酮类药物在0.1~100.0 μg/L范围内线性关系良好（r2≥0.997）。采用在空白速冻肉制品中添加喹诺酮混标的方法，设定目标物质定量离子色谱峰的检出限（SLOD）为3，定量限（SLOQ）为10，得出喹诺酮类药物的检出限为0.3 μg/kg，定量限为1.0 μg/kg。

2.6 回收率与精密度

在空白速冻肉制品中添加16种QNs标准溶液进行加标回收率试验，共添加3个水平（1.0，2.0和10.0 μg/kg），每个水平重复6次，加标回收率和精密度试验结果见表3。

表3 样品中16种喹诺酮类药物的线性方程、相关系数、回收率和精密度（n=6）

目标物质在3个加标水平下的回收率在78.7%~106.4%之间，相对标准偏差SRSD在1.26%~11.59%之间，回收率和精密度符合药物残留分析方法的要求。

2.7 实际样品测定

分别利用所建立的SPE-UPLC-MS/MS分析方法对市售的20批次速冻肉制品（羊肉卷、肥牛卷）进行测定。未检出阳性样品，与标准方法GB/T 20366—2006和GB/T 21312—2007的测定结果一致，然而该方法在检测效率、检测成本、灵敏度等方面优于标准方法。

3 结论

该试验建立了速冻肉制品中16种喹诺酮类抗生素的SPE-UPLC-MS/MS检测方法。试验优化了处理与分析条件，最终选择了0.1%甲酸乙腈溶液进行超声提取，固相萃取净化，HSS T3色谱柱梯度洗脱。方法学评价表明，该方法加标回收率（78.7%~106.4%）和精密度（1.26%~11.59%）良好，方法检出限和定量限分别为0.3和1.0 μg/kg。该方法具有快速、简便、准确、灵敏度高等特点，其灵敏度和准确度均能满足兽药残留检测分析的要求。该方法的建立为速冻肉制品的兽药残留监测提供了有力的工具。