二种高效液相色谱法测定菜籽油中TBHQ的比较分析

贾巧莉 ，陈雪霞 ，范春楠 ，杨金鹏，孙润 ，刘贺*

1.云南省曲靖市质量技术监督综合检测中心（曲靖 655000）；2.云南省肉制品质量监督检验中心（曲靖 655000）；3.昆明学院（昆明 650214）

菜籽油由于其特有的香味，是我国食用植物油消费市场上的当家产品[1]，按照其精炼程度可分为4个等级[2]。一级菜籽油精炼程度最高，四级菜籽油精炼程度最低，一、二级菜籽油具有良好的烹饪性，而三、四级菜籽油保留菜籽原有的香味，同时相比一、二级菜籽油也保留较多的营养成分，各具优点，各个等级菜籽油均受消费者欢迎。但氧化会造成菜籽油色泽和气滋味的变化，菜籽油的质量和营养价值也会降低，为增加菜籽油的保质期[3-4]，我国食品添加剂使用标准GB 2760—2014《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》规定允许添加抗氧化剂，在食用植物油中TBHQ最大使用限量为0.2 g/kg[5]。

根据查询现行国家标准GB 5009.32—2016《食品安全国家标准 食品中9种抗氧化剂的测定》、GB/T 21927—2008《食品中叔丁基对苯二酚的测定 高效液相色谱法》和农业部标准NY/T 1602—2008《植物油中叔丁基羟基茴香醚（BHA）、2, 6-二叔丁基对甲酚（BHT）和特丁基对苯二酚（TBHQ）的测定高效液相色谱法》，植物油中抗氧化剂检测大部分标准是要求使用液相色谱法（HPLC）[6]，结合实际工作，使用高效液相色谱法测定抗氧化剂，结果的稳定性和重复性相比其他仪器更胜一筹[7]，加之高效液相色谱法具有快捷和成本低的优点，在实际工作中使用液相色谱法检测TBHQ更广泛。根据现行有效的3种高效液相色谱方法标准[8-10]，围绕高效液相色谱-荧光检测器（UPLC-FLD）和高效液相色谱法-二极管阵列检测器（UPLC-DAD）方法进行比较分析，以期探索菜籽油中TBHQ检测的最适宜高效液相色谱检测方法，为检验机构的风险防控提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

一级、二级、三级、四级菜籽油各10批次（市售）。

甲醇、乙腈、甲酸、乙酸（均为色谱纯，美国Sigma公司）；特丁基对羟基苯二酚（TBHQ）对照品（1 000 μg/mL，坛墨质检）；质控样（中国检验检疫研究院）；正己烷（分析纯）；水（实验室用超纯水，用前过膜）。

1.2 仪器与设备

戴安UltiMate3000超高效液相色谱仪（配有荧光检测器、二极管阵列检测器）；TTC-3000柱温箱；变色龙色谱工作站；WPS-3000自动进样器；漩涡混匀器（德国IKA公司）；离心机（美国Thermo公司）；分析天平（AE200，精确0.001 mg）；超纯水机（美国Millipore公司）；微孔溶剂过滤器（天津津腾过滤器件厂）；津腾微孔过滤膜（有机相，直径50 mm，孔径0.45 μm）。

1.3 仪器工作条件

1.3.1 使用高效液相色谱法-二极管阵列检测器（DAD）条件（见表1）

表1 UPLC-DAD检测器梯度工作条件

1.3.2 使用高效液相色谱法-荧光检测器（FLD）条件（见表2）

表2 UPLC-FLD测器梯度工作条件

1.4 试验方法

1.4.1 使用二极管阵列检测器样品处理

准确称取约5.0 g（精确至0.001 g）植物油样，置于50 mL具塞离心管中，加入8 mL甲醇，旋涡混匀3次，放置2 min，以5 000 r/min离心5 min，取出上清液于25 mL容量瓶中，残余物每次用8 mL甲醇提取2次，清液合并于25 mL容量瓶中，用甲醇定容，摇匀，0.45 μm滤膜过滤后液相色谱分析。

1.4.2 使用荧光检测器样品处理

准确称取约5.0 g（精确至0.001 g）植物油样，用正己烷溶解并定容至50 mL，移取10.0 mL该溶解液至150 mL分液漏斗中，加入10 mL饱和乙腈，振摇1 min。静置分层，收集下层乙腈层后，加入10.0 mL饱和乙腈，重复萃取1次，合并乙腈层定容至50 mL。经0.45 μm滤膜过滤作为测试液。

1.4.3 检出限测定

精密称取5.0 g空白样品，按照1.4.1和1.4.2小节的样品处理方法，制得空白溶液，用空白溶液将标准工作液稀释至产生3倍信噪比（S/N），计算检出限[11]。

1.4.4 方法回收率和重复性

为验证方法的稳定性和准确性，以四级菜籽油为例，称取5.0 g空白样品于50.0 mL具塞离心管中，加入一定量标准工作溶液，分别按1.4.1、1.4.2样品处理方式操作，配制成10，50和100 mg/kg的低、中、高质量分数的加标回收溶液，进行测定，每个质量分数平行操作6次，计算RSD。

1.5 TBHQ含量计算公式

X=C×M×1 000/（m×1 000） （1）式中：X为样品中TBHQ残留量，mg/kg；C为所测试样样品质量浓度，μg/mL；M为样品定容体积，mL；m为样品质量，g。

2 结果与分析

2.1 标准曲线和检出限

分别移取一定量的1 000 μg/mL TBHQ标准溶液，二极管阵列检测器法用甲醇、荧光检测器法用乙腈稀释，配制成10，20，50，100和200 μg/mL的标准曲线。TBHQ在10~200 μg/mL的质量浓度范围内，以TBHQ标准进样浓度X为横坐标，二极管阵列检测器法纵坐标Y为峰面积，荧光检测器法纵坐标Y为荧光强度，绘制标准曲线，见图3和图4，计算线性回归方程，UPLC-FLD条件下Y=10 760X+5 843.4，R2=0.999 7，UPLC-DAD条件下Y=0.124 6X-1.243 2，R2=0.999 9，表明TBHQ在2种检测条件下R值均大于0.99，在10~200.0 μg/mL的浓度范围内，线性关系良好[12]。2种仪器条件下标准品色谱图见图1和图2，TBHQ抗氧化剂的校准曲线见图3和图4。以3倍信噪比时的进样量计算最低检出限，UPLC-FLD条件下为0.057 mg/kg，UPLC-DAD条件下为0.038 mg/kg，达到检出限要求。

图1 UPLC-FLD法TBHQ标准物质色谱图

图2 UPLC-DAD法TBHQ标准物质色谱图

图3 UPLC-FLD法TBHQ标准曲线

图4 UPLC-DAD法TBHQ标准曲线

表3 四级菜籽油不同质量浓度下的TBHQ回收率结果（n=6）

2.2 方法回收率和重复性

以四级菜子油为例，用空白样品加标回收法测定，配制质量分数分别为10，50和100 mg/kg的低、中、高质量分数溶液，测其平均回收率。结果显示，UPLC-FLD法回收率偏高，为116.5%~128.4%，UPLCDAD测得的回收率为92.4%~96.4%，重复性SRSD均小于5%，表明2种方法重复性良好，但是UPLC-FLD测得结果偏高，为寻找原因，进一步添加质控样进行比较分析，质控分析、加标样及样品分析比较如图5所示。结果显示样品中有干扰物质，如采用UPLC-FLD检验方法，无法将干扰物质和待测物分离开，两者非常接近，所以容易引起误判，经查阅相关资料，该物质分子式是C18H20O5，化学名称是2H-（-苯并呋喃-3,4-二醇）-2-（3, 4-二甲氧基苯）-3, 4-二氢-6甲基-（2α，3α，4α），可能是一种色素[13]。

图5 UPLC-DAD法质控分析、加标样及样品分析比较

2.3 实际应用

将市售的4个等级菜籽油分别按相应的前处理方法进行处理，在液相色谱条件下进行检测，测得结果并计算TBHQ质量分数，一、二级菜籽油分别采用UPLC-FLD、UPLC-DAD法均未检出TBHQ，在三、四级菜籽油中UPLC-FLD方法会发生假阳性，检测结果见表4。

表4 市售菜籽油中TBHQ质量分数

3 结论

通过对高效液相色谱法荧光法和二极管阵列检测菜籽油中TBHQ进行对比分析，2种方法的色谱行为和线性范围、重复性都较良好，均可运用于菜籽油中TBHQ的检测，但由于三、四级菜籽油精炼程度较低，保留大量色素物质，存在TBHQ干扰情况，具有迷惑性，容易引起误判，所以建议在检测精炼程度低的菜籽油时，选择超高效液相色谱-二极管阵列检测器更具方法适用性，在选择高效液相色谱法检测TBHQ时，二极管阵列检测具有定量准确、重复性好、分析速度快、线性良好、操作简便等特点，是一种较为理想的菜籽油中TBHQ含量测定分析方法。