HP-20大孔吸附树脂纯化白薇粗多糖

潘峰 ，罗安桂，李三华，朱欣婷，刘云 *

1.遵义医科大学生命科学研究院（遵义 563000）；2.贵州百灵健康科技有限公司（贵阳 550000）；3.遵义医科大学基础医学院（遵义 563000）

食药两用的白薇，为萝藦科鹅绒藤属植物白薇Cynanchum atratumBunge或蔓生白薇C.versicolorBunge的干燥根及根茎，始载于《神农本草经》，列为中品[1]，其性寒，味苦咸，含白薇素、挥发油、强心苷等，其中强心苷中主要为甾体多糖苷[2]，具有清热凉血、利尿通淋、解毒疗疮的功效。民间也有将白薇作为食疗植物，制作成多种养生饮品，如白薇地骨茶、白芍薇茶等[3-4]。

多糖是由10个以上的单糖经糖苷键连接而成的聚合物，分子量可达数万甚至数百万，且在自然界中广泛分布，具有抗氧化、抗肿瘤、免疫调节、抗菌等多样生物活性[5-8]，在医药、食品和材料领域有着重要应用。多糖广泛存在于高等植物、藻类、菌类及动物体内，且具有极低的毒副作用，使得多糖逐渐成为研究热点，为新药或功能性食品研制提供重要的原材料。如Yu等[9]研究发现一种绞股蓝酸性多糖CPS-1对人肺腺癌细胞系和人胃癌细胞系均具有较好的抑制作用，其24 h抑制活性的IC50分别为284.36 μg/mL和365.27 μg/mL。但是与蛋白质和核酸等大分子物质相比，多糖由于结构更为复杂，其研究仍然相对落后。

传统中药白薇根水提物中含有大量多糖成分，表现出较好的抗肿瘤和抗氧化活性。但是白薇多糖粗提物中含有较多杂质。过多的杂质会阻碍分离纯化、结构特征和活性研究。选择一种低成本、高效除杂方式是白薇多糖开发利用的第一步。为此，根据以往研究经验和文献比对，选取除杂条件温和、成本低且效率较高的大孔吸附树脂为除杂材料，对白薇多糖纯化进行研究。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

白薇植物材料购买自成都荷花池药材市场。大孔吸附树脂（DM101、D101、AB-8、X-5、HP-20、APD100、S-8）（山东东鸿化工有限公司），甘露糖、核糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖和岩藻糖（南京都莱生物技术有限公司）。酒石酸钠、无水碳酸钠、碳酸氢钠、氢氧化钠、盐酸、无水乙醇、苯酚、氯化钠、硫酸等（国产分析纯）。

1.2 仪器与设备

SpectraMax i3x多功能酶标仪（美国Thermo公司），LC-20A高效液相色谱仪（日本岛津公司），蒸发光散射检测器（美国Alltech公司），R-210旋转蒸发仪（瑞士Buchi公司），AQUELIX超纯水处理器（美国Millipore公司），702超低温冰箱（美国Thermo公司），MULTIFUGE XIR高速离心机（美国Thermo公司），Agilent-400M核磁共振仪（Agilent, USA），BS224S电子天平（德国Sartorius公司）。

1.3 植物材料收集及粗多糖的制备

白薇植物材料购买自成都荷花池药材市场。将白薇根粉碎后过0.425 mm（40目）筛。细粉加入95%乙醇，料液比1︰30 g/mL，混匀后超声2 h，过滤，收集残渣，重复2次，以除去脂溶性物质。残渣50 ℃烘干，加入80 ℃预热蒸馏水，料液比1︰30（g/mL），于85 ℃恒温水浴锅提取2 h，过滤，收集滤液。滤液在50 ℃左右减压蒸发浓缩至原体积的20%，加入4倍体积的95%乙醇，4 ℃条件下过夜沉淀，按4 000 r/min离心5 min收集沉淀。沉淀物冷冻干燥得粗多糖。

1.4 吸附指标测定

1.4.1 脱色率测定

吸取100 μL待测多糖溶液于96孔板，于多功能化学发光酶标仪SpectraMax® i3x下测定其420 nm处吸光度，根据式（1）计算脱色率。

式中：A前和A后分别为大孔树脂处理前和处理后多糖溶液在420 nm处的吸光度。

1.4.2 脱蛋白质率测定

蛋白质浓度采用考马斯亮蓝法测定，以牛血清蛋白质为标准品，测定在595 nm处的吸光度，并根据式（2）计算。

式中：C前和C后分别为大孔树脂处理前和处理后多糖溶液中的蛋白质含量，mg/mL。

1.4.3 糖保留率测定

多糖质量浓度采用苯酚-硫酸法测定，以葡萄糖为标准品，测定在490 nm处的吸光度，并根据式（3）计算。

式中：M前和M后分别为大孔树脂处理前和处理后多糖溶液中的多糖质量浓度，mg/mL。

1.4.4 综合隶属度

3种指标反映的是3个方面的信息，为了对吸附特性进行直接比较，引用隶属度的方法[10]，按式（4）计算。

式中：X，Xmax（最大值）和Xmin（最小值）表示色素清除率、蛋白质清除率和多糖保留率值，Xmin≤X≤Xmax。将Y色素清除率值、Y蛋白质清除率值和Y糖保留率相加得到综合隶属度值，根据其大小判断所选用吸附树脂的综合吸附性能，该值越大表明综合吸附能力越强。

1.5 吸附条件优化

1.5.1 树脂类型及吸附时间筛选

准确称取2 g预处理后大孔吸附树脂（X-5、AB-8、S-8、D-101、HP-20、DW-301、APD-100），加入20 mL质量浓度3 mg/mL的粗多糖溶液，密封后，在37 ℃摇床恒温振荡不同时间（10，20，30，40和50 min），每个时间点取少量滤液，测定并计算不同树脂对样品脱色率、脱蛋白质率及多糖保留率，利用加权度函数判断不同树脂的综合吸附效率，并且比较不同吸附时间对其综合吸附效率的影响，确定吸附时间和最佳大孔吸附树脂类型。

1.5.2 质量浓度选择

配制一系列质量浓度（1.0，2.0，3.0，4.0，5.0和6.0 mg/mL）的粗多糖溶液，取20 mL于离心管中，分别加入2 g经预处理筛选出的大孔吸附树脂，37 ℃摇床恒温振荡适当时间（根据前步时间优化所得时间而定，下同），测定并计算溶液的脱色率、脱蛋白质率及多糖保留率，采用加权度函数确定最佳吸附质量浓度。

1.5.3 pH选择

用不同pH的溶剂（pH 4，5，6，7，8，9和10）配制最佳吸附质量浓度的白薇根粗多糖溶液，取20 mL于离心管中，分别加入2 g经预处理的最佳大孔吸附树脂，在37 ℃摇床恒温振荡适当时间，测定并计算溶液的脱色率、脱蛋白质率及多糖的保留率，根据加权度函数值确定最佳pH。

1.5.4 温度选择

在最佳吸附质量浓度、pH和吸附时间条件下，取样品各20 mL，分别在25，30，35，40和45 ℃预热，分别加入2 g筛选出的大孔吸附树脂，对应预热温度恒温振荡，测定并计算溶液的脱色率、脱蛋白质率及多糖保留率，根据加权度函数值确定最佳吸附温度。

1.5.5 柱色谱流速优化

取经预处理的最佳吸附大孔树脂，采用湿法装柱（2.9 cm ID×8 cm），在最佳质量浓度、pH条件下配制适量白薇根粗多糖溶液，以1.0，1.5，2.0，2.5和3.0 BV/h流速过柱，每10 mL收集1管，共收集10管，测定并计算溶液的脱色率、脱蛋白质率及多糖保留率，根据隶属度函数值大小确定最佳流速。

1.6 吸附前后结构特征分析

1.6.1 紫外光谱（UV）分析

取适量吸附前后的多糖样品，用蒸馏水配成约1.0 mg/mL溶液，吸取100 μL装入石英微孔酶标板，并在230~700 nm范围内用SpectraMax®i3x酶标仪进行扫描。

1.6.2 多糖的高效液相凝胶渗透色谱分析

取吸附前后的多糖样品，用高效液相凝胶渗透色谱-蒸发光散射检测器（HPLC-ELSD）法对样品分子量分布进行分析。所用设备为日本岛津LC-20AT高效液相色谱仪系统配以TSK-gel GMPWxl凝胶（7.8 mm ID×30 cm）色谱柱及ELSD检测器。流动相为水，流速0.7 mL/min；ELSD检测器参数：以氮气为载气，气体压力330±10 kPa，漂移管温度115 ℃；样品进样体积10 μL。取一定量的多糖配成约1 mg/mL的溶液，用0.45 μm的滤膜过滤进行色谱分析。

1.6.3 单糖组成分析

吸附前后的多糖样品单糖组分采用强酸水解后利用PMP柱前衍生法结合HPLC-DAD色谱法进行分析。具体步骤参考文献[5]进行。以标准单糖（甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖）采用相同衍生方法配制标准溶液。色谱条件：选用Agilent 1260（Agilent，USA）HPLC系统，配备1根Xtimate ® C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱温35 ℃，进样量10 μL。流动相：A乙腈-B 0.01 mol/L PBS（pH 7.2），以0~22 min，18% A；22~30 min，20%~30% A；30~31 min，30%~100% A进行程序洗脱，流速1.0 mL/min；ELSD检测器以氮气为载气，载气压力约350 kPa。

1.6.4 氢核磁共振谱（1H NMR）分析

取白薇热提多糖吸附前后的样品粉末（约15 mg）溶于0.6 mL重水（D2O）中，在600 MHz的核磁共振仪（Bruker，瑞士）上测定其核磁信号。

2 结果与分析

2.1 白薇多糖的提取

经过脱脂、热水浸提，2.5 kg白薇样品共提取得到40.55 g白薇粗多糖，提取率约1.62%，可见白薇中含有较多的多糖成分。但是白薇多糖冻干颜色较深，含有较多色素成分。同样，如图3（A）所示，白薇粗多糖在260 nm处有明显的吸收峰，表明其含有大量的蛋白质等杂质。过多的色素和蛋白质等杂质会给后续的多糖分离、理化性质和活性功能等研究造成不利影响，尽可能多地除色素和蛋白质等杂质非常重要。

图3 白薇粗多糖经大孔吸附树脂HP-20除杂处理前后紫外吸收谱（A），高效液相凝胶渗透色谱（B），红外吸收光谱（C）和1H NMR谱（D）

2.2 树脂种类筛选

选择价格便宜、使用范围较广的7种不同类型的树脂，以筛选出吸附综合效率较高的树脂类型。如图1所示，所选树脂均可大量吸附粗多糖色素和蛋白质，并对多糖也有不同程度的吸附，但是不同类型大孔吸附树脂的吸附程度存在差异。为综合比较不同树脂吸附效率，选用隶属度函数并求和得综合隶属度，综合隶属度值越大，表示其综合吸附效率越高。通过比较，如图1（D）所示，树脂HP-20在多个吸附时间点上，其综合隶属度值均显著高于其他树脂（p＜0.05），表现出良好的吸附效率。因此选HP-20作为白薇热提粗多糖除杂的树脂。此外，通过比较不同时间HP-20的综合隶属度值变化，结果发现在吸附10 min和吸附40 min时，其值最大，进一步比较发现，吸附40 min时色素清除率和蛋白质清除率明显较吸附10 min高，但是多糖保留率下降，为充分清除色素和蛋白质，选用40 min作为后续研究的吸附时间。

图1 不同类型树脂不同吸附时间的静态吸附结构

2.3 除杂参数优化

如图2（A）所示，当质量浓度较低时，虽然对多糖的吸附较弱，但同样对蛋白质和色素的吸附能力也较低，随着质量浓度升高，其对色素和蛋白质的吸附能力先增加后降低，而多糖保留率先降低后增加，综合考虑三者指标，质量浓度3~5 mg/mL时，其加权度显著高于其他质量浓度（p＜0.05），其中质量浓度5mg/mL时，加权度绝对值最高，表现出较好的综合吸附效率。如图2（B）所示，HP-20对配制的不同初始pH多糖溶液的除杂能力并不相同，偏酸或偏碱溶液均表现出较好的脱色和脱蛋白质能力，而多糖的保留率仍保持在70%以上，综合3项指标，初始pH 5时，具有最高的加权度值，且显著高于其他初始pH的加权度值（p＜0.05），表现出最佳的综合吸附效率。如图2（C）所示，随着温度升高，脱色素率差异不显著，但是脱蛋白质效率逐渐下降，而多糖保留率在35 ℃时最高，温度25 ℃和35 ℃的加权度值均显著高于其他温度的加权度值，但是二者之间不具有显著差异（p＜0.05），考虑到多糖保留率在多糖除杂过程中的重要性[11]，选用吸附温度35 ℃作为后续研究的环境温度。在动态吸附过程中，样品的流速决定其与树脂接触的时间，合适的接触时间对吸附效率也有明显影响。如图2（D）所示，流速2.5和3.0 BV/h时，其加权度值间无显著差异（p＜0.05），且相对最大。但是流速2.5 BV/h时，多糖保留率较高，因此改流速选为最佳流速。通过单因素试验得到大孔吸附树脂HP-20对白薇根热水提取多糖的吸附条件：pH 5的水溶液配制为浓度5 mg/mL，在35 ℃环境温度下，以流速2.5 BV/h过吸附柱。

图2 样品浓度（A）、初始pH（B）、温度（C）和流速（D）对HP-20大孔吸附树脂除多糖杂质的影响

采用优化条件，利用大孔吸附树脂HP-20对白薇粗多糖溶液进行除杂处理，结果如表1所示。粗多糖样品经过树脂吸附后，色素含量下降近70%，蛋白质含量下降超过70%，而多糖含量仅下降约27%，可见HP-20大孔吸附树脂在优化后的条件下，对色素、蛋白质和多糖具有选择吸附特性，在白薇多糖除杂过程中具有较高的效率。

表1 HP-20树脂吸附前后多糖溶液的色素、蛋白质和多糖的含量 单位：%

2.4 树脂吸附过程对结构特征影响

如图3（A）所示，吸附前多糖样品在260~350 nm处有较强的吸收峰，表明其含有较多蛋白质、色素、核酸等杂质。经过HP-20大孔吸附树脂吸附后，这些吸收峰强度明显降低，表明样品中的蛋白质、色素等杂质成分被大量清除。白薇根热提粗多糖经大孔树脂除杂后其分子量分布如图3（B）所示。吸附前在7.5和13.5 min左右有2个较大的峰，吸附后在相近的位置仍有2个主峰，且主峰峰形不变，说明在吸附过程中未发生糖链的断裂。对吸附前后白薇热提粗多糖的单糖组成分析研究表明，吸附前白薇单糖主要由甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、岩藻糖等单糖组成，其中葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖为其主要的单糖成分，而吸附后也均由这几种单糖组成，并且半乳糖和阿拉伯糖仍为其主要单糖成分，但是葡萄糖的相对峰面积显著降低，表明其含量下降，这可能是由于葡萄糖部分以低聚糖形式存在，或其部分并非结合在多糖链上。此外，半乳糖醛酸、岩藻糖的峰面积在吸附后有所增加，这可能是因为其主要存在于多糖链中从而较少被吸附。总之，由图3（C）可知，尽管部分单糖的含量发生少量改变，但是主要单糖成分和含量基本保持一致，也说明大孔吸附树脂HP-20并不会显著改变白薇根热提多糖的单糖组成。1H NMR可以初步表征多糖的部分结构信息，如多糖的单糖构型等信息。通过对多糖吸附前后的1H NMR分析可知（图3D），吸附前后的信号无明显改变，进一步证实大孔吸附树脂HP-20对多糖结构无明显影响。综上可知，大孔吸附树脂HP-20可以高效地清除蛋白质、色素等杂质，不会导致多糖糖链的断裂和结构的破坏，表现出较好的应用潜力。

3 结论

利用大孔吸附树脂吸附法对白薇根热提粗多糖进行除杂纯化研究，结果发现所选的树脂中HP-20树脂对初始浓度5 mg/mL，初始pH 5的多糖溶液，在环境温度35 ℃，流速2.5 BV/h等条件下具有明显的除蛋白质和除色素效果，并且不会造成白薇根热提多糖链的降解和结构的改变。试验所获得的方法可用于白薇根粗多糖的精制和工业化生产，同时对白薇根多糖后续分离纯化和药理活性研究奠定良好基础。