木耳多糖提取分离纯化、结构表征及生物活性研究进展

2022-11-16殷红赵时荆韩姗姗高其芳巩超党张强

食品工业 2022年8期

殷红，赵时荆，韩姗姗，高其芳，巩超党，张强*

1. 陕西省生物农业研究所（西安 710043）；2. 柞水中博金米菌业发展有限公司（商洛 711400）

食用菌是一大类食品，具有独特的滋味和风味，其中黑木耳又是常见的一种食用菌。黑木耳（Auricularia auricular）又叫木耳、木蛾、黑菜、云耳、丁杨，担子菌门，木耳属、木耳科，是一种珍贵的药食同源胶质真菌[1]。木耳资源大约占全世界的90%，中国和日本是木耳的主要产地。我国木耳主要集中在东北和秦岭。黑木耳富含丰富的营养成分，如蛋白质、木耳多糖、矿物质及维生素等，木耳多糖占木耳的65%，也是木耳主要的生物活性成分。木耳多糖有抗氧化、抗凝血、抗肿瘤、抗衰老、降血脂、增强免疫力等多种生物功效。木耳多糖的活性成分与其结构密切相关，包括单糖组成、官能团和糖苷键连接方式等都对活性有着不同的影响。20世纪70年代末到80年代Sone等[2]和Misaki等[3]研究发现黑木耳多糖中含有β-D-葡聚糖和酸性杂多糖，β-D-葡聚糖有水溶性和水不溶性2种。2种β-D-葡聚糖糖苷键连接类型一样都是由β-（1→3）-糖苷链连接而成的，但取代基不同。近年来对木耳多糖的研究主要集中在提取工艺上，对木耳多糖的结构研究越来越受到重视。对结构表征和生物活性的影响离不开多糖的提取工艺，其主要的营养调节机制也成为未来开发新产品的主要研究方向。文章主要对黑木耳多糖的提取分离纯化、结构分析及生物活性现状进行综述，为木耳多糖在食品深加工及生物医学领域提供参考。

1 提取与分离纯化

1.1 木耳多糖的提取

1.1.1 热水浸提法

多糖的提取最常见的方法是热水浸提法。由于热水浸提法具有操作简单、成本低等特点，常被大家所采用，多糖是易溶于水，但木耳本身高黏度、易吸水等特性，导致木耳多糖提取上的料液比大而操作困难，其耗时长。张海燕等[4]对黑木耳多糖提取工艺进行优化，得出在温度100 ℃、液料比1∶70（g/mL）、提取时间4 h时，黑木耳多糖提取率可达到42.56%。张婧涵等[5]研究桑木耳多糖提取工艺，在温度100℃、料液比1∶108（m/V）、时间3.5 h时桑木耳多糖提取率达6.96%，但重复提取10次后，多糖总得率升高到34.18%。木耳多糖热水浸提法提取温度一般在70℃以上，料液比根据木耳种类不同，适时调节，进行重复浸提，提取率在30%以上。在提取工艺中，温度和时间是至关重要的影响因素，影响着多糖的结构稳定性和生物活性，所以水提法提取多糖过程中应控制好工艺的各个影响因素。

1.1.2 超声波提取法

超声波提取是采用超声波辅助溶剂进行提取，通过声波产生高速、强烈的空化效应和搅拌作用，破坏细胞壁，使胞内物质得到释放，溶剂渗透到细胞中，使得木耳多糖更快地溶出，从而缩短提取时间，提高提取率。因此超声波提取多糖具有提取时间短、提取效率高的优点。与热水浸提法比，超声波提取得到的多糖分子三螺旋结构不被破坏而更加完整地被保留，但超声波提取在时间上有局限性，不宜过长，否则多糖分子会断裂，从而降低提取率且成本较大[6]。吴玉柱等[7]以玉木耳为原料，采用超声波辅助法提取多糖，在功率210 W、液料比40∶1 mL/g、温度62 ℃、时间29 min条件下，多糖的得率为7.43%。马昱阳等[8]采用超声波辅助酶提取毛木耳多糖，当液料比40∶1（mL/g）、超声波功率160 W、超声波时间31 min、复合酶酶解温度64 ℃时，多糖提取率为14.41%。

1.1.3 酶解提取法

酶解提取法是将各种酶添加到料液中，如蛋白酶、果胶酶、纤维素酶等，酶的作用使物质细胞壁破裂，胞内物质流出，从而使多糖会更快地溶出到胞外，提高提取率。酶解提取操作简单，提取率较高，多糖的结构不被破坏，但为了保持酶活性，对提取温度和pH有一定的局限性，所以在操作中要严格控制。黄艺宁等[9]在提取温度50.2 ℃、纤维素酶添加量3 774 U/g、pH 4.9、提取时间135 min条件下，得到15.47%白背毛木耳子实体多糖的提取率。

1.1.4 微波提取法

微波提取法是利用一定强度的电磁波把能量传播到组织内部，在外加电场下使组织内部的分子摆动加速，产生摩擦，使温度升高、压力增高，加速组织裂解和细胞破裂，促进多糖提取。林花等[10]以水为提取剂，料液比为1∶40，微波功率为800 W，浸提温度为95 ℃，微波辐射时间为40 min，再用水浴浸提法提取，第一次加水400 mL、1.5 h，第二次加水500 mL、1.5 h，浸提2次，多糖提取率为19.30%。微波提取法在生产中可以节省成本，又节能、安全、高效。

综上所述，木耳多糖的提取方法主要有热水浸提法、超声波提取法、酶解提取法、微波提取法或几种联用，不同的提取方法其多糖的提取率也有所不同，不同产地品种的木耳其提取率也不尽相同，所以在木耳多糖提取中要综合考虑各方面因素，最终选择合适的方法进行后续试验。此外，还有一些利用高压均质法、超声波协同半仿生法、超高压微射流等提取木耳多糖，如：郝慧敏等[11]采用超声波协同半仿生法提取黑木耳多糖的工艺，料液比1∶30（g/mL），超声温度60 ℃，超声功率500 W，超声时间 60 min时，黑木耳多糖提取率为22.52%；秦令祥等[12]采用动态超高压微射流技术提取黑木耳多糖，其最佳工艺条件为提取时间2 h、料液比1∶40（g/mL）、微射流压力140 MPa、提取温度90 ℃，黑木耳多糖得率为22.13%；孔沛筠等[13]采用高温蒸汽浸提木耳多糖，料液比1∶50（g/mL）、提取温度120 ℃，提取时间85 min，此时多糖得率为48.38%±1.64%。在多糖提取过程中，为不破坏其结构和生物活性，建立一种快速、高效、得率高、活性好、成本低的木耳多糖提取方法有待研究者进一步研究。

1.2 木耳多糖分离纯化

木耳中的多糖溶于水后，需分离除去蛋白质等其他大分子而达到单纯的木耳多糖。木耳经提取后得到的是粗多糖，还含有蛋白质、脂肪、色素等大分子物质，为了获得单一的纯多糖组分，必须除去粗多糖中一些非糖成分及杂质后再进一步分离纯化，所以进行脱蛋白、脱脂或脱色处理是必要的步骤。

脱蛋白的常用方法主要有Sevage法、三氟三氯乙烷、鞣酸法、三氯乙酸法、聚酰胺吸附法和酶解法。

木耳提取液中蛋白脱除后还有约1.2%的粗脂肪，根据相似相溶原理，一般采用有机溶剂脱除，如石油醚，也可采用超临界脱脂法。木耳提取液经过脱蛋白、脱脂处理后，溶液颜色较深，有时还需进一步脱色。常用的是活性炭吸附、大孔树脂吸附及过氧化氢氧化。活性炭脱色在吸附中会损失多糖，与其他两种脱色方法比较大孔树脂吸附更常用，对多糖损耗也较小。其他的一些小分子化合物通过透析、超滤等方法可以去除[14]。

经过上述分离处理之后得到的粗多糖还需进一步纯化处理，为后续研究多糖的组成、结构等奠定基础。常用的纯化方法有柱层析法、沉淀法和膜分离法。王理文[15]采用超声提取法对玉木耳进行了粗多糖的提取，并用Sevage法除去蛋白质后，用DEAEcellulose-52柱分离出纯化后的玉木耳多糖，其得率为487.23±12.23 mg/g。许海林[16]将2种黑木耳多糖AAP-10和AAP-80进行分离纯化，进行DEAE-52离子交接层析分离纯化，用不同浓度的NaCl溶液洗脱2种黑木耳多糖，结果发现在去离子水、0.3%和1.5%浓度的NaCl溶液洗脱过程出现洗脱峰，且以1.5%浓度的NaCl溶液洗脱的为主峰，收集此组分，命名为AAP-10-Ⅲ和AAP-80-Ⅲ。对2种黑木耳多糖组分（AAP-10-Ⅲ和AAP-80-Ⅲ）进行Sephacry1TMS-400HR凝胶层析柱分离，结果发现2种黑木耳多糖组分均一，命名为AAP-10-Se和AAP-80-Se。王银平[17]使用DEAE-纤维素DE-52离子交换柱和Sepharose CL-6B凝胶柱对玉木耳多糖进行分离纯化，得到ACPN-1a，ACPN-1b，ACPA-1a，ACPA-1b，ACPA-2a。多糖的分离纯化很复杂，所以通常选用2种或者2种以上的方法结合，得到纯度较高的多糖。

2 木耳多糖结构表征

多糖是一类结构复杂的大分子物质，多糖结构与生物活性息息相关，对多糖结构表征具有重要的研究意义。要研究木耳多糖的结构，首先要知道多糖的纯度、分子量大小，其次确定多糖的单糖组成、糖苷键种类，确定糖苷键的连接方式。明确结构中哪些键影响着多糖的性质。

2.1 木耳多糖纯度鉴定及分子量的测定

木耳多糖的纯度一般采用比旋光法和凝胶色谱法测定。比旋光度法是根据化学结构来判定，相同结构的多糖具有相同的旋光性。若某个多糖样品在纯化前后旋光度没有变化，可认为是均一多糖。凝胶色谱法采用HPLC，通过凝胶柱检测样品，形成的峰形为对称的、单一的峰，则说明多糖为单一组分。

多糖的分子量大小一般从几千万到百万以上，用不同的方法测定多糖分子量也不尽相同。多糖分子量分布比较分散，分子量的表征有采用HPLC测定的平均分子量Mp，渗透压法测定的数均分子量Mn，光散射法测定的重均分子量Mw等。木耳多糖相对分子质量在20～3 000 kDa之间。

2.2 木耳多糖结构分析

多糖的结构分为一级结构和高级结构。确定木耳多糖的结构，要明确木耳多糖一级结构的相对分子质量、单糖组成、糖苷键类型及糖苷键连接方式。木耳多糖的相对分子量的测定通常采用高效凝胶渗透色谱法和高效液相凝胶色谱法。多糖的单糖组成及结构决定着其生物活性。所以对多糖的结构鉴定首要知道其单糖组成，多糖的单糖组成检测首先利用TFA将糖降解为单糖，由于缺少紫外吸收和荧光吸收基团，需对多糖进行衍生化处理之后再运用高效液相色谱法、气相色谱法、纸层色谱、薄层层析色谱、气质联用等测定。通过傅里叶变换红外光谱，检测吡喃环或呋喃环形式。常用高碘酸氧化法、还原裂解、Smith降解和乙酰化方法判断糖苷键位置和相邻单糖基的连接方式。对木耳多糖的高级结构研究还比较少，常采用X射线衍射法、核磁共振技术、圆二色谱法、荧光分析法等，分析多糖的三维结构和构象。

木耳多糖单糖组成主要包括葡萄糖、甘露糖、半乳糖、木糖还含有少量岩藻糖和阿拉伯糖。Sun等[18]从毛木耳子实体中提取得到的多糖单糖组成主要有葡萄糖、甘露糖、半乳糖和葡萄糖醛酸。Xu等[19]从黑木耳中分离纯化出的水溶性中性多糖为β-（1→3）-D-glucan，含有β-（1→6）-D-Glcp侧链；4个多糖组分的多糖纯度几乎都达到90%以上，且不含核酸和蛋白等；2个中性多糖（ACPN-1a和ACPN-1b）的分子量较大，分别为2.18×106Da和2.07×106Da；ACPA-1a展现较宽的分子量分布（5×105～2×106Da），ACPA-2a 的分子量约为 8.5 ×105Da；2个中性多糖组分（ACPN-1a和ACPN-1b），单糖组成主要都包括葡萄糖（96.17%和95.79%），2个酸性多糖组分（ACPA-1a和ACPA-2a）均为杂多糖，单糖组成主要包括甘露糖（44.85%和56.40%）、葡萄糖（16.17%和1.06%）、葡萄糖醛酸（9.35%和10.89%）、木糖（24.26%和28.52%）和其他少量的单糖。鄢为唯[20]研究的黑木耳多糖进一步纯化后单糖组成结果表明AAP1-20仅由葡萄糖（77.82%）组成，AAP1-60含有4种单糖，其中主要是甘露糖（51.91%）与木糖（43.62%），还含有少量的葡萄糖及半乳糖。甲基化分析结果表明，AAP1-20的主要残基包括1, 4,6-linked Glcp、1, 3, 6-linked Glcp、1, 6-linked Glcp和T-linked Glcp，其中1, 3, 6-linked Glcp含量最高；AAP1-60的主要残基包括T-linked Galp、1, 3-linked Xylp、1, 4, 6-linked Manp、1, 4-linked Manp和1,6-linked Glcp，其中1, 4-linked Manp含量最高，并且2种组分的分支度都较高。王秀秀[21]研究2种不同方法提取的木耳多糖的单糖组成，主要含有葡萄糖、木糖、半乳糖、岩藻糖和甘露糖。刘茜等[22]采用热水浸提法提取西北秦巴山区黑木耳多糖，单糖主要由甘露糖、葡萄糖醛酸、木糖组成，相对摩尔百分比为60.87∶20.83∶9.86。Ma等[23]分离的水溶酸性黑木耳多糖经过气相-质谱法和核磁共振法分析其结构，由α-（1-3）-甘露聚糖为主链，在0-6或0-2位上连接β-D-木糖、β-D-葡萄糖和β-D-葡萄糖醛酸。苗晶囡等[24]提取出一种黑木耳酸性多糖，通过测定发现其是由葡萄糖、甘露糖、鼠李糖、木糖和半乳糖组成。秦丹丹[25]采用高效液相色谱（HPLC）、凝胶渗透层析色谱（GPC）、红外光谱（FT-IR）及核磁共振氢谱（1H NMR）分析C-EAAP的结构。试验结果表明，C-EAAP主要由甘露糖（57.1%）、葡萄糖（22.5%）、葡萄糖醛酸（10.0%）、木糖（6.0%）、半乳糖（2.9%）、岩藻糖（1.1%）和鼠李糖（0.4%）构成。AAP和C-EAAP均含有α、β这2种糖苷构型。

由于木耳产地不同，分类有黑木耳、毛木耳、玉木耳等，对木耳多糖的提取及分离纯化的方法也不尽相同，木耳多糖在相对分子量、单糖组成和结构表征上都存在差异。对木耳多糖的单糖组成主要由葡萄糖、甘露糖、木糖、半乳糖构成，糖苷键连接方式也不同，主要由α、β-D-1, 3-葡萄糖和α、β-D-1, 6-葡萄糖连接。

3 木耳多糖生物活性

黑木耳多糖中含有多种糖组分，国内大量研究表明这些多糖组分具有抗肿瘤、抗凝血、抗氧化、抗血栓、提高免疫力、抗炎抗病毒等多种生物活性功能。木耳多糖的提取工艺和结构特征对其生物活性有很大影响。

3.1 抗肿瘤作用

多糖对肿瘤有抑制作用，从而提高细胞的免疫活性，其原因可能是多糖改变了细胞膜成分，使细胞膜上脂肪酸呈游离状态，促进细胞膜脂质过氧化，要进一步研究抗肿瘤机制，需要更深入地了解多糖的结构特征。甘霓等[26]研究不同浓度黑木耳多糖对肿瘤细胞增殖和伤痕愈合率的影响。结果表明，黑木耳多糖在体内外都有明显抗肿瘤作用，与环磷酰胺联合使用，抑制率随着多糖的浓度增加而也大大提高。

3.2 免疫作用

免疫活性的高低与多糖的结构也有一定的关系，黑木耳多糖的β构型、多糖的（1→3）、β-（1→6）糖苷键有较高的免疫活性。高浓度的木耳多糖，对伤口愈合有促进作用。修饰后的木耳多糖其抗病毒活性也会增加，可作为新型抗病毒药物的组成。许海林[16]研究2种木耳多糖组分在环磷酰胺免疫抑制小鼠模型中的免疫调节活性。得到的2种多糖组分对小鼠脾脏指数和巨噬细胞的吞噬功能、脾淋巴细胞增殖和NK细胞活性均有所提高，说明这2种木耳多糖组分对免疫细胞都有影响。

3.3 降血糖、血脂作用

研究黑木耳多糖的降血糖、血脂效果，采用正常小鼠和模型小鼠对比，木耳多糖能降低血糖水平，血脂水平。说明黑木耳多糖和酯化后多糖不仅降低血糖值，而且促进葡萄糖转化为肝糖原，增加肝糖的原合成。通过检测小鼠血清中低密度脂蛋白（LDL）、总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）和高密度脂蛋白（HDL）4个指标，对LDL、TG、和TC水平有显著降低，HDL水平有所升高，所以多糖能够调节血脂[27]。

3.4 抗衰老作用

抗衰老作用可通过检测自由基清除或者建立小鼠模型，对小鼠血浆、小鼠血清、肝脏及脑中SOD、MDA及GSH-PX进行测定，黑木耳多糖能起到抗衰老的作用[28]。

3.5 抗氧化作用

从黑木耳中分离纯化得到不同的多糖组分，通过超氧阴离子和羟基自由基、Fe2+螯合能力检测木耳多糖的抗氧化活性，研究发现多糖抗氧化活性与其所含糖醛酸的量呈正相关。说明含有糖醛酸的黑木耳多糖浓度越高，其抗氧化活性越强。张磊等[29]采用酶解法提取2种不同的食药用真菌多糖，均具有清除自由基作用。在同一浓度条件下，木耳多糖清除率优于其他多糖。王秀秀[21]以羟基、超氧阴离子和DPPH自由基清除率及还原力为指标，分析2种木耳多糖的体外抗氧化性活性，结果表明它们都具有一定抗氧化活性。孔沛筠等[13]通过清除试验、ABTS+·自由基清除试验及DPPH·清除试验发现木耳多糖具有良好的天然抗氧化活性。

3.6 抑菌作用

多糖抑菌作用即对病原菌的杀伤能力，不仅要抑制更重要的还要能够修复调节受损伤的机体，从而提高机体免疫力和对病原菌的防御功能。黑木耳多糖不仅对细菌有抑制，对部分真菌酵母菌也有抑制作用，对霉菌没有明显的抑制作用[30]。

4 展望

木耳是一种药食同源的食用菌，营养丰富、分布广泛，木耳多糖作为天然的高分子化合物，具有一系列生物活性功能如，提高免疫力、抗肿瘤等。将木耳多糖可作为一种新型药物开发，替代一些抗生素等药物来治疗疾病，具有广泛的市场前景。由于木耳本身胶质吸水特性，分子量大，空间结构复杂等特点，在研究木耳多糖方面具有一定的难度。对木耳多糖研究主要集中在多糖的提取工艺和一级结构表征包括单糖组成、分子量大小、糖苷键类型和连接方式上，对其高级结构空间结构研究还不够深入，为进一步明确活性效应机制，探究木耳多糖结构与活性的互作关系，木耳多糖高级结构表征鉴定，增加动物模型确定活体应用下的多糖效果与机制，提高临床应用等，对开发新型药物或者功能性食品发挥着至关重要的作用。