基于网络药理学探讨清化肠饮治疗溃疡性结肠炎作用机制

韩育英，曹刘菁，柯 晓，彭 军，沈阿灵*，陈友琴，4*

（1.福建中医药大学中西医结合研究院，福建 福州 350122；2.福建省中西医结合老年性疾病重点实验室，福建 福州 350122；3.福建中医药大学附属第二人民医院，福建 福州 350003；4.美国凯斯西储大学医学院，俄亥 俄州克利夫兰 44106）

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是一种病因不明的直肠和结肠慢性非特异性炎症性疾病［1］，其在北美洲和欧洲的发病率分别为24.3/10 万和19.2/10 万，在我国乃至亚洲地区，UC 发病率也呈明显上升趋势［2］，但其发病机制尚不明确，一般认为是遗传、环境、肠道菌群、免疫应答等多种因素相互作用的结果［3-4］。目前治疗UC 临床常用药以糖皮质激素、水杨酸制剂、免疫抑制剂为主［5］，尽管这些药物短期疗效良好，但长期使用存在一定的毒副作用［6］，因此，寻找更加安全有效的UC 治疗药物显得尤为重要。

中医学对UC 病名虽无记载，但根据其临床表现，认为UC 属“泄泻”“久痢”“肠癖”等范畴，病机以脾肾亏虚为本虚，以湿热、瘀血、热毒为标实［7］。刘河间在《素问玄机原病式》指出：“诸泻痢皆属于湿，湿热甚于肠胃之内，而肠胃怫郁，以致气液不得宣通而成”［8］，可见，湿热在UC 发病中占有重要地位。清化肠饮（QHCY）是国医大师杨春波教授治疗UC 大肠湿热证的经验方，由仙鹤草、地榆、黄连、赤芍、白豆蔻、厚朴、茵陈、佩兰、薏苡仁、白扁豆、茯苓11 味药组成，具有清热化湿、收敛止血、止痢、泻火解毒、健脾的功效［9］，临床研究证实QHCY 治疗湿热型UC 疗效确切［10］。前期基础研究表明：QHCY 能够通过抑制UC 相关炎性因子的分泌以缓解炎症，维持肠上皮细胞的紧密连接水平以修复肠黏膜机械屏障［11-12］。然而，QHCY 在UC 治疗中的作用机制仍有待进一步阐明，因此，本研究拟通过网络药理学预测和揭示QHCY 治疗UC 作用机制。

1 方 法

1.1 QHCY活性成分收集与筛选 采用中药系统药理学平台（TCMSP，https：//tcmspw.com/tcmsp.php）［13］，在“herbname”检索框中分别以“仙鹤草”“地榆”“黄连”“赤 芍”“白豆 蔻”“厚 朴”“茵陈”“佩兰”“薏 苡仁”“白扁豆”“茯苓”为检索词，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30% 和 类 药 性（druglikeness，DL）≥0.18 作为筛选依据［14］，筛选出11 味中药活性成分信息。

1.2 QHCY 的作用靶点预测 采用TCMSP 数据库对筛选出的QHCY 活性成分进行蛋白靶标获取，然后将获得的蛋白靶标导入Uniprot 数据库（http：//www.Uniprot.org/），转化成统一的基因名，设置基因来源为人源性，从而获得QHCY 活性成分的作用靶点［15］。

1.3 QHCY 治疗UC 作用靶点的收集 在DisGeNET数 据 库（http：//www.disgenet.org/）［16］和GeneCards数据库（https：//www.genecards.org/）［17］中以“ulcerative colitis”为关键词，检索UC 的靶点，去除重复项后，与QHCY 活性成分的作用靶点相映射，得到QHCY 治疗UC 的共同靶点，即作用靶点。

1.4 活性成分-共同靶点网络构建与QHCY 治疗UC 关键活性成分的获取 将共同靶点及对应的活性成分导入到Cytoscape 3.7.2 软件中，构建出活性成分-共同靶点网络图，并导出相关拓扑数据，筛选大于平均度值（degree）的节点，得到QHCY 治疗UC 的关键活性成分。

1.5 构建靶点相互作用（PPI）网络图 将QHCY 与UC 的共同靶点导入String 数据库，物种设置为“homo sapiens”，设定置信度＞0.9，其余参数保持默认设置，获取相互作用关系信息表。将表中数据导入到Cytoscape 3.7.2 软件，绘制共同靶点PPI 网络图，同时对网络进行拓扑结构分析，确定QHCY 治疗UC 的核心靶点［18］。

1.6 GO 和KEGG 富集分析 将共同靶点导入DAVID 数据库（https：//david.ncifcrf.gov/）进行GO 和KEGG 富集分析，以P＜0.001 作为筛选条件，并且依据富集通路涉及基因数的大小，从大到小进行排名，筛选出KEGG 富集分析中排名前20 名的通路及GO 富集分析中排名前10 名的条目。

2 结 果

2.1 QHCY 活性成分及其作用靶点 运用TCMSP分析平台，筛选出不重复而且有作用靶点的活性成分75 个，其中仙鹤草5 个，地榆9 个，黄连11 个，赤芍14 个，白豆蔻14 个，厚朴3 个，茵陈13 个，佩兰7个，薏苡仁6 个，白扁豆1 个，茯苓6 个，见表1。利用Uniprot 数据库确定了不重复的靶点共计241 个，见表1。

表1 QHCY 活性成分信息

续表1

2.2 QHCY 治疗UC 的作用靶点 通过检索得到UC 疾病作用靶点5 168 个，将QHCY 活性成分作用靶点与UC 疾病作用靶点相映射，得到二者共同靶点167 个。

2.3 活性成分-共同靶点网络图分析结果 活性成分-共同靶点网络图中共涉及230 个节点（即共同作用靶点及其对应活性成分的节点）和608 条节点连接线（连接线表示两个节点之间存在相互作用），见图1。由图1 可知：QHCY 治疗UC 并非单一成分或单一靶点的作用，而是多成分、多靶点的联合作用。活性成分节点的平均度值（度值表示某一个节点与其他节点的连接数，度值越大，连接的节点数越多）为9.650 794，其中有19 个活性成分节点的度值高于平均值，为QHCY 治疗UC 的潜在关键活性成分，见表2。

图1 QHCY 活性成分-共同靶点网络图

表2 QHCY 治疗UC 关键活性成分信息

2.4 PPI网络图分析结果 PPI网络图中共有146个节点（即共同作用靶点），705 条节点连接线。将在String 数据库中获得的PPI 网络数据导入Cytoscape 3.7.2 软件，节点平均度值为9.657 534，其中转录因子1（JUN）、肿瘤抗原p53（TP53）、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（AKT1）、转录因子p65（RELA）、丝裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、肿瘤坏死因子（TNF）、原癌基因蛋白（FOS）、连环蛋白β1（CTNNB1）、白介素-6（IL6）、丝裂原活化蛋白激酶14（MAPK14）等61个节点度值高于平均值，即为QHCY 治疗UC 的核心靶点，见图2。

图2 QHCY 共同靶点PPI 网络图

2.5 GO 富集分析 GO 富集分析显示涉及生物过程（BP）214 个，细胞组分（CC）22 个，分子功能（MF）39 个，将排名前10 名的GO 条目绘制柱状图，见图3。

图3 共同靶点的GO 富集分析图

2.6 KEGG 通路分析 经筛选得到87 条信号通路，且根据富集通路涉及基因数的大小，由大到小进行排名，筛选出排名前20 名的通路，见表3。

表3 KEGG 信号通路富集分析结果（前20 名）

3 讨 论

QHCY 活性成分-共同靶点网络中共筛选出19个关键活性成分，包括槲皮素、木犀草素、山柰酚等。槲皮素的综合评分高于其他活性成分，具有免疫调节、抗氧化、抗炎等多种药理作用［19］，可通过抑制炎症因子IL-6、IL-1β 及TNF-α 的释放和增强结肠抗氧化活性来发挥治疗UC 的作用［20］；木犀草素属于黄酮类化合物，具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化和抗菌等多种药理作用［21］，可通过抑制UC 大鼠结肠NF-κB、IL-17 和IL-23 的水平，调节肠道菌群，从而减少UC 大鼠结肠损伤［22］；山柰酚是黄酮醇类化合物的代表成分，具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化、提高机体免疫力等多种功能［23］，可通过下调UC 小鼠血清中一氧化氮与前列腺素E2的水平，增强杯状细胞分泌黏液的功能，从而起到减轻肠黏膜损伤的作用［24］。由此可见，QHCY 筛选出来的活性成分普遍具有抗炎、抗氧化和免疫调节等功能，这可能是其治疗UC 的主要药理作用。

通过对PPI 网络图分析得出61 个关键靶点，在这些靶点中排名靠前且与UC 关系密切的靶点有JUN、TP53、AKT1、RELA 等。JUN 作用于AP-1（c-JUN）信号通路上，在炎性细胞增殖、分化过程中发挥重要作用，其表达与细胞因子、炎性介质的分泌有关［25］；TP53 是目前发现的一种重要的抑癌基因［26］，在UC 发生、发展过程中的作用尚未见报道，但已有研究表明TP53 可作为UC 患者中结肠异型增生和结肠癌筛查的生物指标，可能是治疗UC 相关性结直肠癌患者的潜在靶标［27］；AKT1 具有调节细胞存活、增殖、分化及代谢等功能［28］，有研究表明活化的AKT 可以促进NF-κB 的磷酸化，抑制IκB的蛋白合成而激活NF-κB，进而增加TNF-α、IL-1β 等炎性细胞基因的转录，造成细胞因子IL-6、IL-8 的失衡，进而产生肠黏膜损伤［29］；RELA 作为NF-κB 的一个蛋白质亚单位，其翻译后修饰可以调控NF-κB 的转录激活，并在炎症反应相关性疾病的发生发展过程中发挥着重要作用［30］。

通过KEGG 富集分析可知：QHCY 主要通过调控PI3K/Akt、TNF、MAPK、Toll 样受体、HIF-1 等多种信号通路而达到治疗UC 的作用，这些通路与免疫应答、细胞凋亡、氧化应激和炎症反应密切相关。PI3K/Akt 信号通路可通过激活NF-κB 这一经典炎症通路来调控免疫和炎症反应［31］；TNF 主要由巨噬细胞、T 细胞、树突状细胞等细胞分泌，参与炎症因子生成、白细胞募集、炎性介质合成等过程［32］；MAPK 信号通路的下游包括p38、c-Jun N 端激酶（JNK）与细胞外信号调节激酶（ERK）等信号通路，MAPK 通路的活化可使其下游的p38、JNK 和ERK磷酸化，引起细胞增殖、分化及凋亡等，进而参与炎症反应［33］；Toll 样受体是最早发现的信号分子识别受体，可以通过诱导炎性细胞因子、趋化因子和干扰素的分泌参与炎症反应［34-35］；HIF-1 是应答缺氧应激的转录因子，在炎症疾病的发病过程中高表达［36］。有研究表明：在UC 模型大鼠结肠黏膜中HIF-1、VEGF 含量增高，进一步佐证了UC 的发生、发展与免疫失调和炎症反应密切相关［37］。

综上所述，本研究结果表明QHCY 可能是通过调节免疫应答、炎症反应、氧化应激和细胞凋亡等多种途径发挥治疗UC 的作用。本研究通过网络药理学预测了QHCY 治疗UC 的关键活性成分、核心靶点和信号通路，对QHCY 治疗UC 的分子机制研究提供了参考，但由于本研究仅基于数据挖掘和分析，因此QHCY 对UC 治疗作用的分子机制仍需通过基础实验和临床试验来验证。